AF-hTERT-TK-GCV靶向抗肝癌及旁觀者效應(yīng)的研究.pdf

1、端粒酶是核糖核蛋白復(fù)合體，其主要功能是增加染色體末端端粒的不斷重復(fù)以維護(hù)它的穩(wěn)定性和細(xì)胞的惡性增殖。端粒酶包括兩個(gè)基本成分，端粒酶RNA模板hTR和催化亞單位hTERT(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)。hTERT是端粒酶的最重要成分，它能催化全酶的活性，其啟動(dòng)子是這一功能的核心，因?yàn)樗鼉H在有端粒酶活性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，因此hTERT可作為一個(gè)較為理想的腫瘤治療靶點(diǎn)，以此為突破點(diǎn)，自殺基因可達(dá)到靶向治療肝癌的目的。 目的： 構(gòu)建去唾液酸

2、糖蛋白(AF)-pGL3-人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子-胸甘激酶(TK)，即AF-pGL3-hTERT-TK復(fù)合物，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將其轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞后，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2生長(zhǎng)及凋亡的影響。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)；2.通過(guò)酶切產(chǎn)物的連接，構(gòu)建熒光報(bào)告質(zhì)粒組和治療質(zhì)粒組；3.制備AF標(biāo)記的脂質(zhì)體，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝細(xì)胞L-02；4.用熒光顯微鏡，液閃計(jì)數(shù)儀觀察熒光報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)

3、染細(xì)胞后的熒光，以及hTERT啟動(dòng)子在細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)熒光基因表達(dá)的強(qiáng)弱；5.用TUNEL方法，流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察治療質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)，凋亡及旁觀者效應(yīng)的情況；6.Westernblotting技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染.AF-pGL3-hTERT-TK后肝癌細(xì)胞周期蛋白調(diào)控因子的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建熒光報(bào)告質(zhì)粒組：pGL3-basic(陰性對(duì)照)、pGL3-control(陽(yáng)性對(duì)照)、pGL3-hTERT-Luc+；治

4、療質(zhì)粒組：pGL3-basic-TK(陰性對(duì)照)、pGL3-control-TK(陽(yáng)性對(duì)照)、pGL3-hTERT-TK。 2.使用LuciferaseAssay檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，pGL3-hTERT-Luc+轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后的相對(duì)活性是pGL3-control的60％，但明顯高于陰性對(duì)照pGL3-basic；但是pGL3-hTERT-Luc+轉(zhuǎn)染端粒酶陰性的L-02細(xì)胞后其熒光活性僅為pGL3-Control的13％，說(shuō)明在肝

5、癌細(xì)胞中hTERT啟動(dòng)子有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄活性；相比之下，pGL3-hTERT-Luc+質(zhì)粒在端粒酶陰性的正常肝細(xì)胞L-02中熒光素酶的表達(dá)很弱。 3.在肝癌細(xì)胞中TK(基因可以被hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)高效的表達(dá)，幾乎不影響正常肝細(xì)胞L-02的生長(zhǎng)；AF-通過(guò)識(shí)別ASGPR受體結(jié)合到HepG2細(xì)胞表面，其攜帶的TK基因更易進(jìn)入肝癌細(xì)胞，同時(shí)增強(qiáng)自殺基因TK的表達(dá)效果，在旁觀者效應(yīng)機(jī)制的參與下，肝癌細(xì)胞總的凋亡率達(dá)85％±3％，而正常肝細(xì)