大鼠神經干細胞分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表達及其調節(jié).pdf

1、目的： 本實驗旨在探討大鼠神經干細胞誘導分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表達以及Aβ<,25-5>和人參皂苷Rbl對它們的調節(jié)作用。 方法： 無菌條件下取新生24h大鼠海馬齒狀回分離培養(yǎng)神經干細胞，將第三代處于增殖期的神經干細胞，體外培養(yǎng)并加血清及撤除有絲分裂原誘導分化為神經細胞，運用免疫細胞化學染色方法檢測神經干細胞特異性抗原Nestin和神經細胞標志物NSE及GFAP以評價分化細胞的陽性率。本實驗采

2、用分神經干細胞分化后1w的細胞進行實驗分組：(1)正常組：不另加處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)36h；(2)Aβ<,25～35>處理組：不加處理因素，培養(yǎng)24h后，加入凝聚態(tài)Aβ<,25～35>(20μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)12h；(3)人參皂苷Rbl預處理組：先加入人參皂苷Rbl(10μmol/L)預處理24h,再加入凝聚態(tài)Aβ<,25～35>(20μmol/L)繼續(xù)作用12h。統(tǒng)一收集各組細胞進行實驗檢測。采用：RT-PCR技術檢測神經干細胞分化

3、過程中GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表達。同時應用流式細胞技術分析各組的細胞周期時相分布，觀察不同處理組的細胞增殖情況。另外，應用免疫熒光細胞化學方法觀察PP2A以及活化型GSK-3β(pTyr279,216)的表達。 結果： 1.自新生大鼠海馬齒狀回新鮮分離的單個神經干細胞呈透亮的圓形，數(shù)量較少，雜質較多。傳至第3代(約3w左右)神經球明顯增大，雜質已基本消除。細胞免疫化學染色發(fā)現(xiàn)，神經干細胞標記性蛋白N

4、estin在原代，傳代培養(yǎng)神經球均有表達。神經干細胞誘導分化后3d，大多數(shù)懸浮狀態(tài)生長的神經球開始貼壁，有的細胞呈毛刺狀向外爬行。誘導分化7d后，貼壁神經干細胞團中有大量細胞阿外遷移，并形成長突起，相互交織成網狀。免疫細胞化學檢測顯示，誘導分化后的神經細胞表達神經元特異性表面標志NSE和星形膠質細胞特異性表面標志GFAP。 2.流式細胞儀分析細胞周期時相，結果顯示，Ap<,25～35>組和Rb1預處理組細胞均發(fā)生G0/G1期阻滯

5、，細胞增殖受到抑制，且Aβ<,25～35>組細胞增殖能力下降更明顯。 3.正常組細胞均有GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表達。Aβ<,25～35>組和Rb1預處理組都有強于正常組的GSK-3β和CDK-5的mRNA表達，且它們在Aβ<,25～35>組表達最強，統(tǒng)計分析有顯著性差異(p<0.01)；而PP2A的mRNA在Aβ<,25～35>組和Rb1預處理組的表達都低于正常組，在Aβ<,25～35>組的表達最弱，統(tǒng)計分

6、析有顯著性差異(p<0.01)。 4.免疫熒光細胞化學染色結果顯示：正常組細胞有PP2A的表達，Aβ<,25～35>組和人參皂苷Rb1預處理組細胞PP2A的表達均減弱，其中Aβ<,25～35>組最弱；而Aβ<,25～35>組和人參皂苷Rb1預處理組細胞內活化型GSK-3β(pTyr279，216)的表達均高于正常組，其中Aβ<,25～35>組表達最強。 結論： 1．體外培養(yǎng)的神經干細胞分化后有GSK-3β、CDK