大鼠羊膜上皮細(xì)胞體外向類神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及其移植后對視神經(jīng)再生的作用.pdf

1、視覺系統(tǒng)一些疾病會(huì)造成視神經(jīng)損傷而引起患者失明，目前臨床上尚無良好的治療方法，而視神經(jīng)再生的研究將為治療這些疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過體外培養(yǎng)妊娠晚期大鼠羊膜上皮細(xì)胞，予以免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR等方法鑒定后，應(yīng)用不含血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)大鼠羊膜上皮細(xì)胞向類神經(jīng)干細(xì)胞方向分化，并予以免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR等方法鑒定。然后，將Hoechst33342熒光標(biāo)記的正常羊膜上皮細(xì)胞與誘導(dǎo)后的羊膜上皮細(xì)胞分別移植入大鼠受損視神經(jīng)中，

2、應(yīng)用Hoechst33342熒光追蹤移植細(xì)胞、視網(wǎng)膜HE染色和尼氏染色計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)量、視神經(jīng)HE染色、免疫組織化學(xué)染色等方法初步探討細(xì)胞移植后對視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活和視神經(jīng)軸突再生所產(chǎn)生的作用。結(jié)果表明，應(yīng)用不含血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基可誘導(dǎo)大鼠羊膜上皮細(xì)胞向類神經(jīng)干細(xì)胞方向分化；誘導(dǎo)前后的羊膜上皮細(xì)胞移植入受損視神經(jīng)后，能在損傷部位大量存活并向損傷區(qū)兩端遷移，能提高視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞存活率，增加遠(yuǎn)側(cè)段視神經(jīng)的細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)視神經(jīng)軸突再生。

3、相對來說，誘導(dǎo)后的羊膜上皮細(xì)胞較誘導(dǎo)前的細(xì)胞移植對視神經(jīng)修復(fù)作用更強(qiáng)些。從而提示我們誘導(dǎo)后的羊膜上皮細(xì)胞經(jīng)移植后能促進(jìn)視神經(jīng)損傷的修復(fù)，為臨床修復(fù)視神經(jīng)提供新思路。
　　 目的：目前視覺系統(tǒng)一些疾病如青光眼、視神經(jīng)炎、視神經(jīng)退行性變和外傷等均能造成視神經(jīng)損傷而引起失明，但目前尚無良好治療方法，而視神經(jīng)再生的研究將為治療這些損傷提供新思路。視神經(jīng)損傷后形成的抑制性微環(huán)境是制約視神經(jīng)成功再生的主要原因。近年來，人們己從周圍神經(jīng)移植、

4、細(xì)胞移植和分子調(diào)控三個(gè)層面對視神經(jīng)再生微環(huán)境進(jìn)行調(diào)控。本研究從細(xì)胞移植的角度，體外培養(yǎng)大鼠羊膜上皮細(xì)胞并向類神經(jīng)干細(xì)胞方向誘導(dǎo)后，再移植入大鼠視神經(jīng)損傷模型中，探討誘導(dǎo)后羊膜上皮細(xì)胞對視神經(jīng)修復(fù)的作用。
　　 方法：(1)取妊娠晚期SD大鼠的羊膜組織，序貫消化后進(jìn)行羊膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)。(2)應(yīng)用不含血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)大鼠羊膜上皮細(xì)胞向類神經(jīng)干細(xì)胞方向分化。(3)對正常及誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR鑒定。

5、(4)應(yīng)用Hoechst33342標(biāo)記誘導(dǎo)前后的羊膜上皮細(xì)胞，制作細(xì)胞懸液。(5)將誘導(dǎo)前后的羊膜上皮細(xì)胞移植入成年雄性SD大鼠視神經(jīng)吸斷傷模型中，設(shè)以下4組：正常對照組；損傷組，于眼球后2mm處將微電極玻璃管刺入視神經(jīng)，完全吸除一段長約0.5mm的神經(jīng)，致視神經(jīng)完全斷開，但保持視神經(jīng)外膜和血管完整，于視神經(jīng)缺損處注入5μl無血清培養(yǎng)基；未誘導(dǎo)細(xì)胞組，在損傷組的基礎(chǔ)上，于視神經(jīng)缺損處注入5μl未誘導(dǎo)羊膜上皮細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/ml)

6、；誘導(dǎo)細(xì)胞組，在損傷組的基礎(chǔ)上，于視神經(jīng)缺損處注入5μl誘導(dǎo)的羊膜上皮細(xì)胞懸液(5×106個(gè)/ml)。(6)術(shù)后14d經(jīng)心灌注固定，取眼球視網(wǎng)膜，HE染色觀察計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的數(shù)量。(7)術(shù)后28d經(jīng)心灌注固定，取眼球視網(wǎng)膜鋪片，尼氏染色計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞。(8)術(shù)后28d經(jīng)心灌注固定，制作視神經(jīng)冰凍切片，觀察Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞的存活分布情況。(9)術(shù)后14d、28d視神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)段HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞密度變化。(10)術(shù)

7、后14d，免疫組織化學(xué)染色SABC法顯示各組NF陽性物質(zhì)在近側(cè)段及遠(yuǎn)側(cè)段表達(dá)情況。(11)術(shù)后28 d，免疫組織化學(xué)染色SABC法顯示各組GAP-43陽性物質(zhì)在近側(cè)段表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)體外成功培養(yǎng)獲得大鼠羊膜上皮細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色鑒定羊膜上皮細(xì)胞能表達(dá)上皮特異性標(biāo)志物CK-19、神經(jīng)類細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、GFAP以及細(xì)胞多能性標(biāo)志分子SSEA-4、Vimentin等；RT-PCR鑒定后顯示，羊膜上皮細(xì)胞

8、能表達(dá)外胚層神經(jīng)類細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、GFAP、Tau，中胚層平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SM-22a以及多能性標(biāo)志物SOX-2、Nanog。(2)應(yīng)用不含血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基對大鼠羊膜上皮細(xì)胞向類神經(jīng)干細(xì)胞方向誘導(dǎo)，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)上皮特異性標(biāo)志物CK-19、神經(jīng)類細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、GFAP以及細(xì)胞多能性標(biāo)志分子SSEA-4、Vimentin等；RT-PCR鑒定后顯示誘導(dǎo)后的羊膜上皮細(xì)胞對外胚層神經(jīng)類細(xì)胞標(biāo)志物

9、Nestin、GFAP、Tau表達(dá)較誘導(dǎo)前的表達(dá)增強(qiáng)，而中胚層平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SM-22a以及多能性標(biāo)志物SOX-2、Nanog表達(dá)較誘導(dǎo)前減弱。另外，形態(tài)學(xué)顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞突起較誘導(dǎo)前變長，且可融合成網(wǎng)狀。(3)術(shù)后14 d HE染色計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果顯示損傷組的節(jié)細(xì)胞密度較其他各組明顯降低，細(xì)胞移植組的節(jié)細(xì)胞密度較損傷組明顯增加但仍低于正常組，誘導(dǎo)細(xì)胞組的節(jié)細(xì)胞密度高于未誘導(dǎo)細(xì)胞組。(4)損傷后28 d，尼氏染色視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)

10、胞的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示損傷組的節(jié)細(xì)胞密度較其他各組明顯降低，細(xì)胞移植組的節(jié)細(xì)胞密度較損傷組明顯增加但仍低于正常組，誘導(dǎo)細(xì)胞組的節(jié)細(xì)胞密度高于未誘導(dǎo)細(xì)胞組。(5)將Hoechst33342核標(biāo)記細(xì)胞移植入大鼠視神經(jīng)吸斷傷模型后，傷后28 d取視神經(jīng)冰凍切片，可觀察到損傷區(qū)有大量標(biāo)記的存活細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞能向受損視神經(jīng)近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段遷移。(6)HE染色視神經(jīng)顯示，損傷區(qū)有大量細(xì)胞存在，呈不規(guī)則條索狀分布并向兩端延伸。傷后14、28 d計(jì)數(shù)遠(yuǎn)側(cè)段細(xì)胞

11、結(jié)果顯示，未誘導(dǎo)細(xì)胞組和誘導(dǎo)細(xì)胞組的細(xì)胞數(shù)量較損傷組和正常組明顯增多，誘導(dǎo)細(xì)胞組的細(xì)胞數(shù)量多于未誘導(dǎo)細(xì)胞組。(7)傷后14 d免疫組織化學(xué)法染色后顯示損傷組視神經(jīng)遠(yuǎn)、近側(cè)段NF表達(dá)顯著下降，著色較淺，并出現(xiàn)串珠樣結(jié)構(gòu)，未誘導(dǎo)細(xì)胞組和誘導(dǎo)細(xì)胞組的神經(jīng)遠(yuǎn)、近側(cè)段的NF陽性物質(zhì)較損傷組增多，而誘導(dǎo)細(xì)胞組的神經(jīng)遠(yuǎn)、近側(cè)段的NF陽性物質(zhì)多于未誘導(dǎo)細(xì)胞組，另外近側(cè)段的NF陽性物質(zhì)多于遠(yuǎn)側(cè)段。(8)傷后28 d免疫組織化學(xué)法染色后顯示損傷組視神經(jīng)GA