系統(tǒng)性紅斑狼瘡及腎移植急性排斥反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄因子活性差異的分析.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一種累及全身多個系統(tǒng)的難以預(yù)料的自身免疫性疾病,其最常見和最嚴重的并發(fā)癥為狼瘡性腎炎(Lupus nephritis),臨床統(tǒng)計SLE患者中有腎損害的達到95%,而病理活檢結(jié)果更是接近100%。自從糖皮質(zhì)激素與免疫抑制劑被用于治療SLE后,患者的預(yù)后雖已經(jīng)有明顯改善,但總的來說該病治療現(xiàn)狀仍不容樂觀,有約15%的患者在發(fā)病5年內(nèi)死亡和出現(xiàn)腎功能衰竭,同

2、時復(fù)發(fā)也是治療過程中面臨著的一個嚴峻問題。而腎移植是目前終末期腎病患者最理想、最經(jīng)濟的一種治療方法,但移植后急性排斥反應(yīng)嚴重影響著移植物及受者的存活。目前,移植腎活檢是能明確診斷排斥反應(yīng)的唯一方法,但此法即昂貴又不方便還易引起腎損傷導(dǎo)致各種并發(fā)癥。因此新的有效、方便的SLE和排斥反應(yīng)早期生物標記的發(fā)現(xiàn),將能大大提高SLE與腎移植治療效率。在此方面研究人員做了大量工作,當前臨床上治療SLE普遍采用糖皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑從整體抑制機體的

3、免疫功能,對該病存有的免疫功能紊亂可謂是沒有目標性,缺乏靶向性。同時這些藥物副作用大,很多患者由于副作用而被迫停藥,致使治療中斷。在排斥反應(yīng)方面,主要方向為使用先進的科學(xué)技術(shù)從蛋白尿和患者外周血中尋找排斥反應(yīng)的早期生物標記,但目前這些研究成果都還未能運用于臨床上轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor,TF)又稱為反式作用因子,是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白,通過它們之間以及與其它相

4、關(guān)蛋白之間的相互作用,激活或抑制轉(zhuǎn)錄。一個轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控數(shù)百個基因的表達,而一個基因的表達又可受數(shù)個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能缺陷,與人類的一些疾病(如腫瘤和炎癥)相關(guān),許多轉(zhuǎn)錄因子還是藥物作用的靶點。新的生物標記能及時、可靠、特異地預(yù)示SLE患者和移植物的趨勢,有助于進一步闡述SLE和排斥反應(yīng)的發(fā)生機制。本研究的目的在于應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子芯片技術(shù),篩選在SLE和腎移植急性排斥反應(yīng)中活性差異表達顯著的TF,進一步探討TF在SLE和腎

5、移植急性排斥反應(yīng)中的作用機制。研究材料與方法：1.10例取自健康自愿者外周血的單個核細胞為正常細胞對照組,15例取自SLE患者外周血的單個核細胞為SLE細胞實驗組；取3例自腎腫瘤切除術(shù)中遠離腫瘤組織且病理檢查正常的腎皮質(zhì)做為實驗組織對照組,3例腎移植急性排斥反應(yīng)患者腎穿標本做為腎移植急性排斥組。2.按照試劑盒說明抽提細胞核蛋白,bradford法用蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度,定量后分裝,-80℃凍存。3.標記所提取總核蛋白中的TF,濃縮

6、標記樣品,采用TranSignalTM Protein/DNA Array試劑盒進行TF芯片雜交。4.通過X膠片曝光,使用Genepix 4000B進行圖像掃描,并轉(zhuǎn)換為灰度TIFF格式的圖片文件保存；采用ScanAlyze軟件分析數(shù)據(jù),分析結(jié)果導(dǎo)出,最終用EXCEL文件表示。5.電泳遷移率變動分析(EMSA)實驗驗證芯片結(jié)果。實驗結(jié)果：1.所提取的細胞核蛋白經(jīng)過定量檢測符合芯片實驗需求。2.SLE細胞實驗組和對照組芯片研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)92

7、個TF差異表達顯著,其中78個表達顯著上調(diào),14個表達顯著下調(diào)。3.利用芯片比較分析急性組織排斥組和對照組TF表達,發(fā)現(xiàn)99個TF差異表達顯著。其中95個表達顯著上調(diào),4個TF表達顯著下調(diào)。4.篩選SLE細胞實驗組和急性排斥反應(yīng)組中差異表達顯著的AP-1,Pbx1和MEF-2轉(zhuǎn)錄因子進行電泳遷移率變動分析實驗研究,其結(jié)果均符合芯片分析結(jié)果。實驗結(jié)論：1.微陣列芯片是有效的高通量分析SLE及腎移植急性排斥反應(yīng)TF差異表達的研究手段。2.使

8、用芯片篩選出92個在SLE患者中差異表達顯著的TF；99個在腎移植急性排斥反應(yīng)中差異表達顯著的TF,證實TF在SLE和腎移植急性排斥反應(yīng)中出現(xiàn)顯著的差異表達。3.用電泳遷移率變動分析實驗對所挑選的3個TF進行定量表達研究,其結(jié)果與芯片結(jié)果一致,證實了芯片結(jié)果的可靠性。電泳遷移率變動分析實驗是檢測單個TF表達水平的有效手段。TF有可能是SLE和腎移植急性排斥反應(yīng)的新的有效生物標記。差異表達TF的研究有助于進一步了解SLE和腎移植急性排斥反