石杉堿甲對衰老小鼠肝臟胰島素信號通路與氧化應激-炎癥的作用機制研究.pdf

1、背景：
　　隨著人們生活水平的提高，人口老齡化逐漸加速，衰老相關(guān)疾病已成為威脅人類健康的主要敵人。因此，對衰老機制及衰老相關(guān)疾病的研究越發(fā)重要，近年來得到廣泛的重視和關(guān)注。目前衰老的確切機制尚不清楚。衰老進程的一個主要特征是促炎-抗炎反應失衡，促炎癥反應狀態(tài)慢性進行性升高，導致慢性低度炎性狀態(tài)，有研究表明胰島素抵抗也是一個慢性炎癥過程，且隨年齡上升胰島素抵抗發(fā)生率增加。石杉堿甲是一種可逆的、選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI)

2、，目前國內(nèi)臨床廣泛應用于神經(jīng)退行性疾病的治療，如阿爾茨海默病。然而，關(guān)于石杉堿甲能否影響衰老肝臟的胰島素信號通路及氧化應激-炎癥，目前的研究不多。胰島素是機體重要的細胞內(nèi)生長因子，可通過胰島素受體底物(IRS)，調(diào)節(jié)下游的PI3K/Akt/FOXO/NF-κ B信號通路，參與氧化應激-炎癥及衰老的調(diào)控。同時，炎癥和衰老又可以反過來影響胰島素信號轉(zhuǎn)導，這使三者之間存在密切聯(lián)系。因此，設想:石杉堿甲能通過影響胰島素活性調(diào)節(jié)下游的PI3K/A

3、kt/FOXO3a/NF-κ B信號通路，參與調(diào)節(jié)衰老小鼠肝臟的炎癥，進而保護肝臟，延緩衰老。
　　目的：
　　1.比較各組血液、肝臟胰島素水平，探討石杉堿甲對衰老所致胰島素水平變化的作用。
　　2.比較各組肝臟PI3K、Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a的表達水平，進一步探討石杉堿甲能否通過insulin/PI3K/Akt/ FOXO信號通路調(diào)節(jié)肝臟細胞的氧化應激-炎癥。
　　3.比較各組肝臟M

4、nSOD、MDA、NF-κ B表達，探討石杉堿甲對衰老大鼠肝臟氧化應激-炎癥的影響。
　　方法：
　　1.3月齡清潔級雄性小鼠36只，按隨機數(shù)字表法平均分為三組:(1)石杉堿甲組（石杉堿甲0.1mg/Kg/d皮下注射）;(2)石杉堿甲+石杉堿甲拮抗劑組（石杉堿甲0.1mg/Kg/d*12個月+石杉堿甲拮抗劑5mg/Kg*3個月聯(lián)合皮下注射）;(3)對照組（生理鹽水皮下注射）。每組各12只小鼠，實驗時間持續(xù)12個月。
　

5、　2.留取血液及肝臟組織，測定血液及肝臟組織胰島素指標，比較三組胰島素表達情況。
　　3.免疫組織化學染色測定肝臟PI3K、Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a表達，Western Blot分析測定肝臟PI3K、Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a表達，利用圖像分析軟件對結(jié)果進行半定量測定，三組計量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學比較分析。
　　4.留取肝臟勻漿，全自動生化分析儀測定MnSOD指標，評估抗氧化酶能力

6、。免疫組織化學染色測定肝臟NF-κ B、MDA表達，Western Blot分析測定肝臟NF-κ B、MDA表達，利用圖像分析軟件進行半定量分析，三組計量數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學比較。
　　結(jié)果：
　　1.肝臟組織中石杉堿甲組胰島素水平低于對照組（F=14.125，P=0.02），石杉堿甲+拮抗劑組胰島素水平也低于對照組（F=20.353，P=0.011），與石杉堿甲組無顯著差異(F=3.086，P=0.154)。血液中石杉堿甲組胰島素

7、水平明顯低于對照組（F=11.543，P=0.002），石杉堿甲+拮抗劑組胰島素水平也低于對照組（F=5.425，P=0.025），與石杉堿甲組無顯著差異（F=0.410，P=0.527）。這提示，石杉堿甲可一定程度上降低衰老所致血液、肝臟組織中的胰島素增加，石杉堿甲拮抗劑聯(lián)合皮下注射3個月對其無明顯影響。
　　2.免疫組織化學染色顯示，肝臟PI3K、p-Akt、p-FOXO3a表達在三組間也有明顯差異(P＜0.01)，其中以對照

8、組表達最高，石杉堿甲組表達最低(P＜0.01)。肝臟Akt、FOXO3a表達在三組間有明顯差異（P＜0.05），其中以對照組表達最低，石杉堿甲組表達最高（P＜0.05）。Western Blot半定量分析也顯示，與對照組相比，石杉堿甲組肝臟FOXO3a表達明顯上升(P＜0.001)。石杉堿甲+拮抗劑組FOXO3a表達低于石杉堿甲組(P＜0.05)，但仍高于對照組(P＜0.05)。與對照組相比，石杉堿甲組肝臟p-FOXO3a表達明顯下降(

9、P＜0.001)。石杉堿甲拮抗劑干預可減弱這一下降效應(P＜0.001)，但仍低于對照組(P＜0.001)。表明石杉堿甲可抑制肝臟胰島素信號通路，降低肝臟PI3K、p-Akt的表達，減少FOXO3a磷酸化。石杉堿甲拮抗劑可干預這一效應。
　　3.分光光度法測定顯示，石杉堿甲組肝臟MnSOD表達水平顯著高于對照組（F=32.018，P＜0.01），石杉堿甲+拮抗劑組MnSOD表達水平居于對照組(F=15.399，P=0.002)和石

10、杉堿甲組(F=6.262，P=0.023)之間。提示石杉堿甲有助于肝細胞MnSOD表達，促進細胞抗氧化能力，延緩衰老，石杉堿甲拮抗劑可抑制這種作用。
　　4.免疫組織化學染色顯示，MDA表達在三組間有明顯差異(P＜0.05)，其中以對照組表達最高，石杉堿甲組表達最低(P＜0.05)。NF-κ B表達在三組間也有明顯差異(P＜0.01)，其中以對照組表達最高，石杉堿甲組表達最低(P＜0.01)。表明石杉堿甲可有效抑制肝臟MDA、NF

11、-κ B表達。MDA表達在三組間有明顯差異(P＜0.05)，其中以對照組表達最高，石杉堿甲組表達最低(P＜0.01)。NF-κ B表達在三組間有明顯差異(P＜0.01)，其中以對照組表達最高，石杉堿甲組表達最低（P＜0.01）。Western Blot半定量分析顯示，與對照組相比，石杉堿甲組肝臟MDA表達下降(P＜0.001)。石杉堿甲拮抗劑干預組表達較石杉堿甲組升高(P＜0.001)，但仍低于對照組(P＜0.01)。這提示，石杉堿甲對

12、衰老肝臟細胞氧化應激有抑制作用，可以減少肝臟MDA、NF-κB的表達，石杉堿甲拮抗劑可以抑制這一效應。推測石杉堿甲對氧化應激的抑制可能與石杉堿甲對胰島素/PI3K/Akt/FOXO3a信號通路的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.石杉堿甲可降低衰老小鼠肝臟的胰島素水平，聯(lián)合石杉堿甲拮抗劑皮下注射3個月對其作用無明顯影響。
　　2.石杉堿甲可抑制衰老小鼠肝臟胰島素/PI3K/Akt/FOXO3a信號通路，參與調(diào)控肝臟細胞