石杉?jí)A甲對(duì)衰老小鼠肝臟胰島素信號(hào)通路與氧化應(yīng)激-炎癥的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　隨著人們生活水平的提高，人口老齡化逐漸加速，衰老相關(guān)疾病已成為威脅人類健康的主要敵人。因此，對(duì)衰老機(jī)制及衰老相關(guān)疾病的研究越發(fā)重要，近年來得到廣泛的重視和關(guān)注。目前衰老的確切機(jī)制尚不清楚。衰老進(jìn)程的一個(gè)主要特征是促炎-抗炎反應(yīng)失衡，促炎癥反應(yīng)狀態(tài)慢性進(jìn)行性升高，導(dǎo)致慢性低度炎性狀態(tài)，有研究表明胰島素抵抗也是一個(gè)慢性炎癥過程，且隨年齡上升胰島素抵抗發(fā)生率增加。石杉?jí)A甲是一種可逆的、選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI)

2、，目前國內(nèi)臨床廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療，如阿爾茨海默病。然而，關(guān)于石杉?jí)A甲能否影響衰老肝臟的胰島素信號(hào)通路及氧化應(yīng)激-炎癥，目前的研究不多。胰島素是機(jī)體重要的細(xì)胞內(nèi)生長因子，可通過胰島素受體底物(IRS)，調(diào)節(jié)下游的PI3K/Akt/FOXO/NF-κ B信號(hào)通路，參與氧化應(yīng)激-炎癥及衰老的調(diào)控。同時(shí)，炎癥和衰老又可以反過來影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這使三者之間存在密切聯(lián)系。因此，設(shè)想:石杉?jí)A甲能通過影響胰島素活性調(diào)節(jié)下游的PI3K/A

3、kt/FOXO3a/NF-κ B信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)衰老小鼠肝臟的炎癥，進(jìn)而保護(hù)肝臟，延緩衰老。
　　目的：
　　1.比較各組血液、肝臟胰島素水平，探討石杉?jí)A甲對(duì)衰老所致胰島素水平變化的作用。
　　2.比較各組肝臟PI3K、Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討石杉?jí)A甲能否通過insulin/PI3K/Akt/ FOXO信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞的氧化應(yīng)激-炎癥。
　　3.比較各組肝臟M

4、nSOD、MDA、NF-κ B表達(dá)，探討石杉?jí)A甲對(duì)衰老大鼠肝臟氧化應(yīng)激-炎癥的影響。
　　方法：
　　1.3月齡清潔級(jí)雄性小鼠36只，按隨機(jī)數(shù)字表法平均分為三組:(1)石杉?jí)A甲組（石杉?jí)A甲0.1mg/Kg/d皮下注射）;(2)石杉?jí)A甲+石杉?jí)A甲拮抗劑組（石杉?jí)A甲0.1mg/Kg/d*12個(gè)月+石杉?jí)A甲拮抗劑5mg/Kg*3個(gè)月聯(lián)合皮下注射）;(3)對(duì)照組（生理鹽水皮下注射）。每組各12只小鼠，實(shí)驗(yàn)時(shí)間持續(xù)12個(gè)月。
　

5、　2.留取血液及肝臟組織，測(cè)定血液及肝臟組織胰島素指標(biāo)，比較三組胰島素表達(dá)情況。
　　3.免疫組織化學(xué)染色測(cè)定肝臟PI3K、Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a表達(dá)，Western Blot分析測(cè)定肝臟PI3K、Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a表達(dá)，利用圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量測(cè)定，三組計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。
　　4.留取肝臟勻漿，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定MnSOD指標(biāo)，評(píng)估抗氧化酶能力

6、。免疫組織化學(xué)染色測(cè)定肝臟NF-κ B、MDA表達(dá)，Western Blot分析測(cè)定肝臟NF-κ B、MDA表達(dá)，利用圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，三組計(jì)量數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
　　結(jié)果：
　　1.肝臟組織中石杉?jí)A甲組胰島素水平低于對(duì)照組（F=14.125，P=0.02），石杉?jí)A甲+拮抗劑組胰島素水平也低于對(duì)照組（F=20.353，P=0.011），與石杉?jí)A甲組無顯著差異(F=3.086，P=0.154)。血液中石杉?jí)A甲組胰島素

7、水平明顯低于對(duì)照組（F=11.543，P=0.002），石杉?jí)A甲+拮抗劑組胰島素水平也低于對(duì)照組（F=5.425，P=0.025），與石杉?jí)A甲組無顯著差異（F=0.410，P=0.527）。這提示，石杉?jí)A甲可一定程度上降低衰老所致血液、肝臟組織中的胰島素增加，石杉?jí)A甲拮抗劑聯(lián)合皮下注射3個(gè)月對(duì)其無明顯影響。
　　2.免疫組織化學(xué)染色顯示，肝臟PI3K、p-Akt、p-FOXO3a表達(dá)在三組間也有明顯差異(P＜0.01)，其中以對(duì)照

8、組表達(dá)最高，石杉?jí)A甲組表達(dá)最低(P＜0.01)。肝臟Akt、FOXO3a表達(dá)在三組間有明顯差異（P＜0.05），其中以對(duì)照組表達(dá)最低，石杉?jí)A甲組表達(dá)最高（P＜0.05）。Western Blot半定量分析也顯示，與對(duì)照組相比，石杉?jí)A甲組肝臟FOXO3a表達(dá)明顯上升(P＜0.001)。石杉?jí)A甲+拮抗劑組FOXO3a表達(dá)低于石杉?jí)A甲組(P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，石杉?jí)A甲組肝臟p-FOXO3a表達(dá)明顯下降(

9、P＜0.001)。石杉?jí)A甲拮抗劑干預(yù)可減弱這一下降效應(yīng)(P＜0.001)，但仍低于對(duì)照組(P＜0.001)。表明石杉?jí)A甲可抑制肝臟胰島素信號(hào)通路，降低肝臟PI3K、p-Akt的表達(dá)，減少FOXO3a磷酸化。石杉?jí)A甲拮抗劑可干預(yù)這一效應(yīng)。
　　3.分光光度法測(cè)定顯示，石杉?jí)A甲組肝臟MnSOD表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（F=32.018，P＜0.01），石杉?jí)A甲+拮抗劑組MnSOD表達(dá)水平居于對(duì)照組(F=15.399，P=0.002)和石

10、杉?jí)A甲組(F=6.262，P=0.023)之間。提示石杉?jí)A甲有助于肝細(xì)胞MnSOD表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞抗氧化能力，延緩衰老，石杉?jí)A甲拮抗劑可抑制這種作用。
　　4.免疫組織化學(xué)染色顯示，MDA表達(dá)在三組間有明顯差異(P＜0.05)，其中以對(duì)照組表達(dá)最高，石杉?jí)A甲組表達(dá)最低(P＜0.05)。NF-κ B表達(dá)在三組間也有明顯差異(P＜0.01)，其中以對(duì)照組表達(dá)最高，石杉?jí)A甲組表達(dá)最低(P＜0.01)。表明石杉?jí)A甲可有效抑制肝臟MDA、NF

11、-κ B表達(dá)。MDA表達(dá)在三組間有明顯差異(P＜0.05)，其中以對(duì)照組表達(dá)最高，石杉?jí)A甲組表達(dá)最低(P＜0.01)。NF-κ B表達(dá)在三組間有明顯差異(P＜0.01)，其中以對(duì)照組表達(dá)最高，石杉?jí)A甲組表達(dá)最低（P＜0.01）。Western Blot半定量分析顯示，與對(duì)照組相比，石杉?jí)A甲組肝臟MDA表達(dá)下降(P＜0.001)。石杉?jí)A甲拮抗劑干預(yù)組表達(dá)較石杉?jí)A甲組升高(P＜0.001)，但仍低于對(duì)照組(P＜0.01)。這提示，石杉?jí)A甲對(duì)

12、衰老肝臟細(xì)胞氧化應(yīng)激有抑制作用，可以減少肝臟MDA、NF-κB的表達(dá)，石杉?jí)A甲拮抗劑可以抑制這一效應(yīng)。推測(cè)石杉?jí)A甲對(duì)氧化應(yīng)激的抑制可能與石杉?jí)A甲對(duì)胰島素/PI3K/Akt/FOXO3a信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.石杉?jí)A甲可降低衰老小鼠肝臟的胰島素水平，聯(lián)合石杉?jí)A甲拮抗劑皮下注射3個(gè)月對(duì)其作用無明顯影響。
　　2.石杉?jí)A甲可抑制衰老小鼠肝臟胰島素/PI3K/Akt/FOXO3a信號(hào)通路，參與調(diào)控肝臟細(xì)胞