5-氨基乙酰丙酸-光動力療法對人食管癌效應(yīng)及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 食管癌是人類常見的消化道惡性腫瘤,我國是全世界該腫瘤發(fā)病率及死亡率的高發(fā)國家。其死亡率在我國惡性腫瘤中居第四位。其中約90％的食管癌病理類型為鱗癌。而在西方國家,該發(fā)病率亦日益增加,但病理類型主要為Barrett's食管發(fā)展而來的腺癌。由于大部分患者確診時已是晚期,甚至存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或食管梗阻,使這些患者失去了手術(shù)的最佳時機,甚至不能耐受放化療。因此,一種新的治療手段一光動力療法(PDT),成為這些患者的迫切需求

2、。目前,光動力治療已經(jīng)被證實是食管癌的一種有前景的治療模式。
　　 因此,本課題選擇二代光敏劑ALA,通過研究ALA-PDT在食管癌的體內(nèi)外效應(yīng)探討其最佳作用參數(shù),為臨床光動力治療最佳參數(shù)的選擇提供一定依據(jù)。通過研究ALA-PDT對食管癌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及線粒體膜電位的影響、ALA的亞細(xì)胞定位以及一些相關(guān)基因及蛋白的變化以探討其主要作用機制。
　　 研究目的：
　　 1.通過研究ALA-PDT在食管癌的體內(nèi)外效

3、應(yīng)探討其最佳作用參數(shù)；
　　 2.通過研究ALA的亞細(xì)胞定位、ALA-PDT對食管癌細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期及線粒體膜電位的影響初步探討ALA-PDT在食管癌的凋亡機制；
　　 3.通過研究ALA-PDT對食管癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Bcl-xL,Bad、Bak-1、FADD、Bid表達(dá)的變化探討其可能作用的主要凋亡通路；
　　 4.通過研究Bcl-2、cytochrome c(cytc)的蛋白表達(dá)變化

4、以探討ALA-PDT凋亡通路的終末效應(yīng)機制。
　　 研究方法及內(nèi)容
　　 1.MTT法檢測ALA-PDT對食管癌細(xì)胞Eca-109的光動力效應(yīng):實驗分為對照組和光動力治療組,光動力治療組給予不同濃度的ALA(0.01mM,0.05mM。0.1mM,0.25mM,0.5mM,1mM,2mM)和不同孵育時間(分別孵育4 h、6 h、12 h、24 h)后于飽和光劑量下((30J/cm2)進(jìn)行光照,同時設(shè)立另一治療組,給予不同

5、濃度的ALA(0.01mM,0.05mM,0.1mM,0.25mM,0.5 mM,1mM,2mM)后于三種不同光劑量(10J/cm2,30J/cm2,50J/cm2)下進(jìn)行光照,光源采用DIOMED 630PDT系統(tǒng),光照后孵育24小時,通過MTT法檢測細(xì)胞生存率。
　　 2.ALA-PDT對人食管癌細(xì)胞Eca-109荷瘤裸鼠的增殖抑制:建立人食管鱗癌裸鼠種植瘤模型,每3天監(jiān)測腫瘤瘤徑,待腫瘤大小為150～350mm3時,開始給

6、予行光動力治療。實驗分對照組、ALA-PDT組(給予光敏劑及光照),單純光照組(只給予光照)、單純光敏劑組(只給予光敏劑)(每組6只),ALA-PDT組及單純光敏劑組按100 mg/Kg腹腔給藥,給藥4小時后,ALA-PDT組與單純光照組開始進(jìn)行光動力治療。光源采用DIOMED 630PDT系統(tǒng),按120J/cm2光劑量進(jìn)行光照,光照后監(jiān)測腫瘤體積及觀察腫瘤表面皮膚變化,并于治療后第21天處死裸鼠,取瘤組織進(jìn)行H&E染色的檢測。

7、　　 3.熒光共聚焦顯微鏡檢測光敏劑及線粒體探針在細(xì)胞內(nèi)的定位:予細(xì)胞加入ALA(終濃度為2mM)孵育4小時后予線粒體綠色熒光探針(MTG)(終濃度為100mM)避光孵育30分鐘后于熒光共聚焦顯微鏡FV1000檢測其光敏劑及線粒體探針的亞細(xì)胞定位。4.AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)檢測ALA-PDT對Eca-109細(xì)胞凋亡的影響:實驗分為對照組和光動力治療組。光動力治療組加入ALA并使其終濃度分別為0.05mM和0.5mM,避光

8、培養(yǎng)6小時后于630nm Diomed光動力治療系統(tǒng)下進(jìn)行光照(功率200mW/cm2,照光150 s,光劑量30J/cm2)。光照24小時后收集細(xì)胞,加入AnnexinV-FITC(5ul)和PI(5ul)避光孵育10分鐘后于流式細(xì)胞儀上檢測其凋亡情況。
　　 5.PI檢測ALA-PDT對Eca-109細(xì)胞周期的影響:實驗分為對照組和光動力治療組。光動力治療組加入ALA并使其終濃度分別為0.05mM、0.1mM和0.5mM,避

9、光培養(yǎng)6小時后于630nm Diomed光動力治療系統(tǒng)下進(jìn)行光照(功率200mW/cm2,照光150 S,光劑量30J/cm2)。光照24小時后收集細(xì)胞,70％的酒精于4℃固定至少12小時后加入PI(終濃度為1mg/ml),避光孵育10分鐘后于流式細(xì)胞儀上檢測其細(xì)胞周期情況。
　　 6.Hoechst 33342/PI檢測ALA-PDT作用后Eca-109細(xì)胞凋亡情況:實驗分為對照組和光動力治療組。光動力治療組加入ALA并使其終

10、濃度分別為0.05mM、0.1mM和0.5mM,避光培養(yǎng)6小時后于630nm Diomed光動力治療系統(tǒng)下進(jìn)行光照(功率200mW/cm2,照光150 s,光劑量30J/cm2)。光照24小時后收集細(xì)胞,加入Hoechst 33342及PI,避光孵育15分鐘后于熒光顯微鏡BX51觀察其凋亡情況。
　　 7、羅丹明123染色檢測ALA-PDT對Eca-109細(xì)胞線粒體膜電位的影響:實驗分為對照組和光動力治療組。光動力治療組加入AL

11、A并使其終濃度分別為0.05mM、0.1mM和0.25mM,避光培養(yǎng)6小時后于630nm Diomed光動力治療系統(tǒng)下進(jìn)行光照(功率200 mW/cm2,照光150 s,光劑量30J/cm2)。光照1小時后收集細(xì)胞,加入羅丹明123染液,避光孵育30分鐘后用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,繼續(xù)孵育60min后于熒光顯微鏡BX51觀察。
　　 8.實時定量PCR法檢測Bcl-2、Bax、Bad、Bcl-xL、Bak-1、FADD、Bid的基因表達(dá)

12、變化:實驗分為對照組和ALA-PDT組。治療組細(xì)胞給予ALA(終濃度為0.25mM)孵育6小時后于630nm Diomed光動力治療系統(tǒng)下進(jìn)行光照(功率200mW/cm2,照光150 s,光劑量30J/cm2)。于光照后24 h收集細(xì)胞,并提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用SYBR熒光定量試劑于AB17500PCR儀上檢測Bcl-2、Bax、Bad、Bcl-xL、Bak-1、FADD、Bid的基因表達(dá)變化情況。
　　 9.

13、Western Blotting法檢測Bcl-2、cytc(胞漿)蛋白含量的變化:實驗分為對照組和ALA-PDT組。治療組細(xì)胞給予ALA(終濃度為0.25mM)孵育6小時后進(jìn)行于630nm Diomed光動力治療系統(tǒng)下進(jìn)行光照(功率200mW/cm2,照光150 s,光劑量30J/cm2)。于光照后24 h收集細(xì)胞,并分別提取細(xì)胞總蛋白和胞漿蛋白,采用Western Blotting法檢測Bcl-2、cytc蛋白含量的變化。
　　

14、 10.統(tǒng)計分析:所有數(shù)據(jù)采用spss 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。實驗結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。細(xì)胞生存率的分析采用析因設(shè)計的方差分析。各組體積的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及細(xì)胞生存率、腫瘤體積的多組間比較均采用單向方差分析,多重比較在方差齊性時采用LSD檢驗,方差不齊時采用近似F檢驗(Welch方法)及多重比較的Dunnett'sT3方法。對照組與治療組之間基因及蛋白表達(dá)相對量的差異分析均采用獨立樣本

15、t檢驗。P值<0.05時其差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 1.ALA-PDT對人食管癌細(xì)胞Eca-109有顯著的增殖抑制作用。在特定光源狀態(tài)下,光照劑量、光敏劑孵育濃度及孵育時間是Eca-109細(xì)胞體外光動力效應(yīng)的主要影響因素。在特定孵育時間下(孵育時間為24 h),當(dāng)孵育濃度為0.5mM,光照劑量為50J/cm2時其殺傷效應(yīng)最強。而當(dāng)孵育濃度由0.5mM增至2.0mM時,光劑量由30J/cm2增加至50J/cm2

16、時殺傷效應(yīng)達(dá)到平臺期。特定光劑量下(光劑量為30J/cm2),當(dāng)孵育濃度為2.0mM,孵育時間為24小時其殺傷效應(yīng)最強。而當(dāng)孵育濃度由0.5mM增至2.0mM時,孵育時間由6小時增至24小時其殺傷效應(yīng)亦達(dá)到平臺期。以上結(jié)果表明,要達(dá)到ALA-PDT對人食管癌細(xì)胞Eca-109細(xì)胞的最佳殺傷效應(yīng),需選擇最佳作用參數(shù)。
　　 2.ALA-PDT對Eca-109荷瘤裸鼠有顯著增殖抑制作用。其效應(yīng)在治療后第7天最明顯,第14天開始增長加

17、快,因此治療后第14天可作為復(fù)照的參考時間。
　　 3.H&E染色、Hoechst 33342/PI染色從組織學(xué)的形態(tài)上進(jìn)一步證明了ALA-PDT對人食管癌細(xì)胞的殺傷作用。
　　 4.ALA-PpⅨ部分定位于線粒體上,ALA-PDT使Eca-109細(xì)胞線粒體膜電位發(fā)生改變可能為其使細(xì)胞死亡的機制之一。
　　 5.ALA-PDT可使Eca-109細(xì)胞發(fā)生凋亡；隨著ALA濃度增加,凋亡率呈上升趨勢。
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18、.ALA-PDT可使Eca-109細(xì)胞明顯阻滯于G0/G1期,且隨著ALA濃度增加呈上升趨勢。ALA-PDT對細(xì)胞周期的阻滯可能為其凋亡作用機制之一。
　　 7.外源性通路不是ALA-PDT誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡的主要通路,其主要凋亡通路為線粒體誘導(dǎo)的凋亡通路。Bcl-2基因及蛋白的表達(dá)在PDT后24 h均顯著下調(diào),表明Bcl-2可能為該凋亡通路的靶基因之一。
　　 8.釋放cytc進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能為ALA-PD