表皮生長因子受體在曲譜瑞林逆轉(zhuǎn)卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞對順鉑耐藥中的作用.pdf

1、研究背景:化療是臨床上晚期卵巢癌的主要治療手段之一,目前卵巢癌化療的一線藥物以鉑類為主,但是腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物表現(xiàn)出的耐藥性的逐漸增強(qiáng)已經(jīng)顯著限制了其臨床療效。因此,為解決晚期卵巢癌對鉑類藥物耐藥的難題,尋找有效的化療增敏藥物以制定更佳的化療方案,改善患者的生活質(zhì)量,國內(nèi)外學(xué)者做了許多的研究。 流行病學(xué)研究顯示,甾體激素在卵巢癌的發(fā)生中起到一定的作用,促性腺激素、雌激素以及雄激素可能是致病因子,而促性腺激素釋放激素(gonado

2、tropinreleasing hormone,GnRH)可能是保護(hù)因子。GnRH是下丘腦肽能神經(jīng)元分泌的一種十肽激素,其在體內(nèi)的重要功能是由GnRH受體介導(dǎo)完成的。有研究發(fā)現(xiàn),除垂體外,在人類的一些惡性腫瘤細(xì)胞中也有GnRH及其受體的表達(dá)。目前臨床應(yīng)用人工合成的GnRH類似物(gonadotropin releasing hormone analog,GnRHa)治療多種性激素依賴性腫瘤(如乳腺癌,前列腺癌等),機(jī)制在于此類藥物和Gn

3、RH受體結(jié)合,通過垂體的“去勢作用”而抑制性激素的分泌,或直接對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗增殖作用。 許多研究表明,約80％的卵巢癌組織中有GnRH及其受體的表達(dá),GnRHa對卵巢癌細(xì)胞系的抗增殖作用與抑制表皮生長因子受體(epidermal growth factor recaptor,EGFR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。正常卵巢上皮組織中EGFR表達(dá)量很低或缺如,但70％以上的卵巢癌組織中有EGFR高水平表達(dá)。GnRHa與受體結(jié)合后激活磷酸

4、酪氨酸磷酸酶(Phosphotyrosine phosphatase,PTP),抵抗表皮生長因子(epidermal growthfactor,EGF)誘導(dǎo)的EGFR酪氨酸自磷酸化作用,從而干擾表皮生長因子受體上的有絲分裂信號轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制癌細(xì)胞的增殖。 最近,有研究指出卵巢癌細(xì)胞通過EGFR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)的增強(qiáng),導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對鉑類藥物耐藥性的增加,而下調(diào)或抑制EGFR表達(dá)可以增加癌細(xì)胞對化療的敏感性。有關(guān)GnRH類似物作為化

5、療逆轉(zhuǎn)劑逆轉(zhuǎn)人類乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥性研究已被證實(shí),而GnRH類似物對卵巢癌耐藥細(xì)胞的化療逆轉(zhuǎn)作用,目前較少有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了卵巢癌順鉑耐藥的體外細(xì)胞模型,觀察GnRH類似物曲譜瑞林(Triptorelin)對逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的效果,為卵巢癌臨床聯(lián)合化療提供新的思路。 研究目的:觀察體外實(shí)驗(yàn)中曲譜瑞林逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的效果,并初步探討其作用相關(guān)機(jī)制。 方法和結(jié)果: 第一部分實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

6、 實(shí)驗(yàn)方法： 體外建立卵巢癌順鉑耐藥亞細(xì)胞系OVCAR-3/DDP: 1、采用濃度梯度遞增法,基于人類卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞系誘導(dǎo)建立卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系模型,命名為OVCAR-3/DDP; 2、MTT法測定IC50、耐藥指數(shù)(RI);3、流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情況。 結(jié)果: 1、采用濃度梯度遞增法對OVCAR-3細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo),歷時(shí)10個月獲得其耐藥細(xì)胞亞系,在濃度為3μmol/L的順

7、鉑環(huán)境下能生長良好,于無藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月耐藥性穩(wěn)定,命名為OVCAR-3/DDP細(xì)胞； 2、細(xì)胞周期FCM分析:相對于親本OVCAR-3細(xì)胞,其順鉑耐藥株OVCAR-3/DDP細(xì)胞對數(shù)生長期的增殖速度減慢,細(xì)胞多數(shù)分布于G0/G1期,細(xì)胞主要處于潛伏期,增殖緩慢,S期細(xì)胞數(shù)目明顯減少,從而避開順鉑主要作用的細(xì)胞周期S期； 3、MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析:OVCAR-3細(xì)胞對順鉑的IC50為6.22μM,OVCAR-3/D

8、DP對順鉑的IC50為83.48μM,耐藥指數(shù)(RI)為13.42。 第二部分實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果 實(shí)驗(yàn)方法：研究曲譜瑞林對OVCAR-3/DDP細(xì)胞的化療逆轉(zhuǎn)作用及耐藥細(xì)胞表面EGFR表達(dá)改變 1、實(shí)驗(yàn)分組:選取兩藥的血藥峰值濃度(Cmax)作為聯(lián)合作用的基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)0.01、0.1、1、10、100倍Cmax共5個濃度梯度,分為:I、耐藥細(xì)胞順鉑處理組；II、耐藥細(xì)胞曲譜瑞林處理組；Ⅲ、耐藥細(xì)胞兩藥聯(lián)合處理組(處理濃

9、度為相同梯度倍數(shù)的濃度值相加);IV、耐藥細(xì)胞未處理組；V、親本細(xì)胞未處理組。 2、比較I-IV不同加藥情況下細(xì)胞抑制率的差異； 3、MTT法檢測IC50、化療逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RR):RR=IC50(順鉑處理組)/IC50(順鉑+曲譜瑞林聯(lián)合處理組);金式公式求q值分析兩藥是否具有協(xié)同作用； 4、EGFR流式免疫熒光測定:采用流式細(xì)胞儀將各組別EGFR(RPE)標(biāo)記好的細(xì)胞應(yīng)用Cell quest軟件程序進(jìn)行資料處理。

10、計(jì)算分別以Cmax-T、Cmax-D、Cmax-(T+D)作用和不加藥處理四種情況下各組耐藥細(xì)胞樣品中表達(dá)EGFR的細(xì)胞陽性率及單個細(xì)胞表達(dá)EGFR的平均熒光強(qiáng)度,以此表示其相對含量。 結(jié)果:曲譜瑞林對OVCAR-3/DDP細(xì)胞的化療逆轉(zhuǎn)作用及耐藥細(xì)胞表面EGFR表達(dá)改變: 1、各組細(xì)胞生長情況比較:順鉑組、曲譜瑞林組的耐藥細(xì)胞生長狀況與耐藥細(xì)胞未加藥處理組接近,兩組間各時(shí)間點(diǎn)的生長抑制率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0

11、.05)：而兩藥聯(lián)合處理組的耐藥細(xì)胞生長受到較明顯抑制,與單用順鉑處理組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 2、采用MTT法及Excel軟件加權(quán)線性回歸法計(jì)算I-Ⅲ不同加藥組別耐藥細(xì)胞的IC50,化療逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RR)為3.91：根據(jù)金氏公式求q值為1.75,q值>1說明曲譜瑞林和順鉑對耐藥細(xì)胞的聯(lián)合作用為協(xié)同作用。 3、耐藥細(xì)胞的EGFR表達(dá)改變：與單藥處理組及未加藥處理組細(xì)胞比較,在兩藥聯(lián)合處理組中表達(dá)EGFR的細(xì)

12、胞陽性率明顯下降(P<0.01),且單個細(xì)胞表達(dá)EGFR的熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.01)。提示聯(lián)合用藥時(shí),耐藥細(xì)胞表面EGFR的表達(dá)顯著下調(diào)。 結(jié)論: 1、成功建立了卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞亞系OVCAR-3/DDP,為研究逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥提供了體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?2、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,曲普瑞林與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可部分逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞OVCAR-3/DDP對順鉑的耐藥性,且兩藥聯(lián)合對耐藥細(xì)胞的殺傷作用為協(xié)同作用；