XAV939對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生長抑制及順鉑增敏作用.pdf

1、背景與目的:卵巢癌，以卵巢上皮性癌（EOC）為主，是女性婦科腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，也是婦科最致命的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1999-2010年間我國卵巢癌的總體粗死亡率為7.91/10萬，年齡校正總死亡率為5.35/10萬。由于缺乏用于早期診斷的特異性指標(biāo)及該病發(fā)病的隱匿性，大部分卵巢上皮性癌患者因癥狀出現(xiàn)而就診時(shí)已處于臨床晚期，而傳統(tǒng)的化療方案則因癌細(xì)胞化療藥物抗性的產(chǎn)生難以達(dá)到治療效果，使得該病的治療遇到了前所未有的挑戰(zhàn)。因此，更好地研

2、究與卵巢癌發(fā)生發(fā)展及耐藥性獲得相關(guān)的分子機(jī)制，從而找到早期診斷靈敏度高的特異性指標(biāo)和針對性強(qiáng)且副作用小的分子靶向治療藥物已迫在眉睫。
　　最近一些國內(nèi)外學(xué)者均發(fā)現(xiàn)，目前在腫瘤治療方面研究相當(dāng)火熱的Wnt/β-catenin通路的活化可能參與了卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及其化療藥物的耐受。研究證明在卵巢上皮性癌中存在一些表達(dá)上調(diào)的Wnt/β-catenin通路成員蛋白，例如細(xì)胞外信號蛋白 Wnt-1、通路核心蛋白β-catenin及下游靶基因

3、轉(zhuǎn)錄蛋白c-myc、cyclinD1，其中β-catenin參與了卵巢癌細(xì)胞的異常增殖和轉(zhuǎn)移。因此，如果找到可以抑制該通路中任意環(huán)節(jié)的靶向性藥物，我們便有望解決化療藥物毒副作用大和腫瘤耐藥這兩大世界性難題，為每一位腫瘤患者帶來希望。
　　端粒酶作為端粒長度的“守衛(wèi)員”，早在上世紀(jì)末就被證明在許多惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其中也包括婦科死亡率最高的卵巢癌，Murakami等通過對卵巢良性、交界性及惡性腫瘤組織的分析發(fā)現(xiàn)，92％的組織中端粒

4、酶呈現(xiàn)高表達(dá)，且腫瘤分化程度與酶的活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。目前，有不少學(xué)者正在嘗試將端粒酶的特異性抑制劑應(yīng)用于腫瘤的治療中，主要集中于肝癌、鼻咽癌、胃癌及卵巢癌等方面，也取得了一定的成效，但并沒有為腫瘤的獲得性藥物耐受問題帶來幫助。
　　端錨聚合酶（Tankyrase）是一種多功能蛋白酶，其一方面利用糖基化功能抑制Tankyrase1/2的活性，為端粒酶提供作用位點(diǎn)并維持染色體末端穩(wěn)定性；另一方面則可增加錨蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而加速β-cat

5、enin降解，介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路的正向運(yùn)行。XAV939是Huang，S. M等學(xué)者于2009年基于抑制β-catenin轉(zhuǎn)錄而篩選出的Wnt/β-catenin通路特異性小分子抑制劑，他們利用定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，其發(fā)揮作用主要依賴于介導(dǎo)錨蛋白穩(wěn)定性的增加，促進(jìn)該通路的“開關(guān)蛋白”β-catenin的降解，進(jìn)而對腫瘤達(dá)到治療效果。
　　本次研究將端錨聚合酶抑制劑 XAV939作用于人卵巢腺癌順鉑原發(fā)耐藥細(xì)胞

6、株（SKOV3細(xì)胞株），并檢測細(xì)胞用藥后的增殖、凋亡情況及細(xì)胞核質(zhì)內(nèi)Tankyrase、cyclinD1和β-catenin的表達(dá)情況，以期為卵巢癌小分子靶向治療藥物的研發(fā)和耐藥的逆轉(zhuǎn)提供新的方向。
　　材料與方法:人卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外復(fù)蘇并培養(yǎng)至對數(shù)期，將這些細(xì)胞分為端錨聚合酶抑制劑（XAV939）組、順鉑組、兩者聯(lián)合組及對照組，以 MTT法分別檢測不同藥物濃度作用下各組細(xì)胞的增殖及抑制情況；再以流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同濃度的

7、XAV939對SKOV3細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期的影響；然后以Western blot法檢測SKOV3細(xì)胞中Tankyrase、cyclinD1及β-catenin的表達(dá)情況，并以不同濃度的XAV939作用于SKOV3細(xì)胞48小時(shí)后再次檢測三種蛋白表達(dá)量的變化。
　　實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量數(shù)據(jù)以SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)定為α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1、XAV939及DDP對SKOV3細(xì)胞的生長抑制作用：XAV93

8、9與DDP在體外對卵巢癌SKOV3細(xì)胞均有一定的抑制作用，且抑制作用的強(qiáng)弱與藥物作用濃度及作用時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)，即存在濃度和時(shí)間的依賴現(xiàn)象。
　　2、XAV939對SKOV3細(xì)胞的順鉑增敏作用：以0.8μM的XAV939分別聯(lián)合DDP各濃度作用于SKOV3細(xì)胞48小時(shí)后，小濃度時(shí)細(xì)胞抑制率高于DDP單藥組，SKOV3細(xì)胞對順鉑的敏感性增加（IC50(DDP)=69.059μg/ml IC50（XAV939+DDP）=52.254μg

9、/ml）。
　　3、XAV939對 SKOV3細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的影響：細(xì)胞周期及凋亡檢測顯示，與對照組相比 XAV939作用后細(xì)胞的凋亡率隨著藥物濃度的增加呈增高趨勢，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。增加 XA939作用濃度后，細(xì)胞呈現(xiàn)G0/G1期阻滯，S期細(xì)胞所占百分比下降，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴。
　　4、XAV939對SKOV3細(xì)胞中Tankyrase、CyclinD1、β-catenin蛋白表達(dá)量的影響：蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，T

10、ankyrase、cyclinD1、β-catenin在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)；當(dāng)XAV939作用后三者的表達(dá)量均明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1. XAV939及DDP單藥于體外對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株具有一定細(xì)胞毒作用，且具有時(shí)間及劑量依賴的特點(diǎn)。
　　2. XAV939與DDP合用時(shí)可增加SKOV3細(xì)胞對DDP的敏感性，加速細(xì)胞的凋亡。
　　3. XAV939可能通過降低Tankyrase和β-