人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對(duì)HLA半相合造血干細(xì)胞移植小鼠GVHD調(diào)節(jié)作用的探索.pdf

1、造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment，HIM)是造血干/祖細(xì)胞定殖、分化、發(fā)育和成熟的場(chǎng)所?；|(zhì)細(xì)胞作為造血微環(huán)境中的重要成分，不僅與造血細(xì)胞的自我更新、增殖分化、歸巢定位以及在血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中密切相關(guān)，在免疫調(diào)節(jié)中也具有重要的作用。因此，深入探討基質(zhì)細(xì)胞對(duì)造血及免疫的影響，對(duì)血液學(xué)的研究和發(fā)展十分重要。 異基因造血干細(xì)胞移植是目前治療血液腫瘤的有效手段之

2、一，但僅有30％的患者能夠找到全相合的供者。HLA半相合造血干細(xì)胞移植可使90％的患者找到相合的供者，但HLA半相合造血干細(xì)胞移植面臨植入失敗率高、造血重建慢、GVHD重、免疫重建遲、致死性感染發(fā)生率發(fā)生高、移植相關(guān)死亡率高等諸多障礙。因此，調(diào)控GVHD，達(dá)到降低HLA半相合造血干細(xì)胞移植相關(guān)死亡率和提高患者的生存率，是目前臨床工作亟待解決的問題。 本科室在前期工作中證實(shí)，臍血中存在基質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞，并能通過特定的細(xì)胞因子組合使

3、人臍血源基質(zhì)細(xì)胞(human umbilical cord blood- derived stromal cells。hUCBDSCs)得以有效擴(kuò)增；擴(kuò)增后的hUCBDSCs具有支持造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的作用。研究hUCBDSCs的免疫調(diào)節(jié)作用是一個(gè)新的探索課題。 基于上述分析，本課題首先對(duì)hUCBDSCs原代培養(yǎng)MNCs的分離條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)體外探討hUCBDSCs對(duì)小鼠GVHD調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步對(duì)hUCBDSCs在HLA半相

4、合造血干細(xì)胞移植小鼠的造血重建及GVHD調(diào)節(jié)作用進(jìn)行初步的探討。 一、本研究的主要內(nèi)容和研究方法 1.采用6％明膠聯(lián)合Percoll兩步分離法，改良Dexter基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系行hUCBDSCs培養(yǎng)，采用倒置顯微鏡觀察不同分離方法培養(yǎng)的hUCBDSCs生長(zhǎng)狀況，瑞士染色觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行細(xì)胞鑒定；CCK-8檢測(cè)hUCBDSCs的增殖； 2.體外進(jìn)行混合細(xì)胞培養(yǎng)，采用CCK-8檢測(cè)hUCBDS

5、Cs對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖作用；采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期的變化；采用流式細(xì)胞儀術(shù)、熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)混合細(xì)胞培養(yǎng)中CD49b NK細(xì)胞、CD3 T細(xì)胞及CD49d粘附分子的表達(dá)變化，ELISA檢測(cè)混合細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IFN-y細(xì)胞因子表達(dá)變化；采用掃描電子顯微鏡及熒光免疫組織化學(xué)進(jìn)一步研究混合細(xì)胞培養(yǎng)中淋巴細(xì)胞粘附hUCBDSCs情況，初步探討hUCBDSCs在體外對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，并以人骨髓基

6、質(zhì)細(xì)胞(hBMSCs)作為對(duì)照； 3.以親代C57BL/6(H-2d♀)小鼠作為供體鼠，BABL/C(H-2b♂)×C57BU6(H-2d♀)的F1代(H-2b×d)為受體鼠，60COγ射線全身照射后，受體鼠接受供體鼠來源的骨髓細(xì)胞1×107個(gè)/只及脾細(xì)胞1×107個(gè)，只，進(jìn)行HLA半相合造血干細(xì)胞移植，觀察移植后小鼠存活期、嵌合率、GVHD臨床表現(xiàn)和病理變化，構(gòu)建HLA半相合造血干細(xì)胞移植小鼠GVHD模型； 4.將體外

7、培養(yǎng)的1×106個(gè)/只hUCBDSCs輸入HLA半相合造血干細(xì)胞移植小鼠體內(nèi)，觀察hUCBDSCs對(duì)小鼠造血重建及CFU-F、CFU-GM、CFU-E、CFU-Mg形成能力的影響； 5.在構(gòu)建的GVHD模型基礎(chǔ)上，加入1×106個(gè)/只hUCBDSCs，觀察GVHD的發(fā)生情況；采用流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)移植后受體小鼠脾臟不同時(shí)項(xiàng)點(diǎn)CD49b NK細(xì)胞、CD3 T細(xì)胞及CD49d粘附分子的表達(dá)，ELISA檢測(cè)受體小鼠外周血上清中不同時(shí)項(xiàng)點(diǎn)

8、IL-4和IFN-γ細(xì)胞因子的表達(dá)，熒光免疫組織化學(xué)檢測(cè)受體小鼠GVHD靶器官粘附分子CD49d的表達(dá)； 6.觀察CM-DiI標(biāo)記的hUCBDSCs在HLA半相合造血干細(xì)胞移植受體小鼠體內(nèi)的遷移分布情況。 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.hUCBDSCs原代培養(yǎng)MNCs分離條件的優(yōu)化：采用6％明膠對(duì)臍血紅細(xì)胞的沉降效果明顯優(yōu)于3％的明膠；6％明膠聯(lián)合Percoll分離法在MNCs和CD34+細(xì)胞的回收率上明顯優(yōu)于3％明膠聯(lián)合F

9、icoll分離(p<0.05)；6％明膠聯(lián)合Percoll分離法培養(yǎng)的hUCBDSCs在細(xì)胞增殖、48 h細(xì)胞貼壁數(shù)、細(xì)胞開始伸展時(shí)間、基質(zhì)細(xì)胞集落開始形成及達(dá)最大的時(shí)間、細(xì)胞融合時(shí)間及培養(yǎng)成功率上明顯優(yōu)于3％明膠聯(lián)合Ficoll分離法；兩種分離法在細(xì)胞化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞形態(tài)等生物學(xué)特征無差別。 2.hUCBDSCs對(duì)小鼠GVHD的體外調(diào)節(jié)作用：hUCBDSCs具有促進(jìn)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中的淋巴細(xì)胞增殖的作用，hUCBD

10、SCs聯(lián)合thIL-2促增殖作用更強(qiáng)(p<0.05)，hUCBDSCs培養(yǎng)上清無促增殖作用；hUCBDSCs明顯增加混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞S期和G2/M期的比例(p<0.05)； hUCBDSCs和hBMSCs均促進(jìn)CD49b NK細(xì)胞、降低CD3 T細(xì)胞和粘附分子CD49d(VLA-4)的表達(dá)，hUCBDSCs的作用更強(qiáng)(p<0.05)； hUCBDSCs和hBMSCs均促進(jìn)IL-4、降低JFN-γ表達(dá)，hUCBDSCs的作用

11、更強(qiáng)(p<0.05)； hUCBDSCs具有抑制CD49bIFN-γ NK1和CD49bIT-4 NK2細(xì)胞的表達(dá)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，粘附于hUCBDSCs的淋巴細(xì)胞越來越少，粘附細(xì)胞通過偽足與hUCBDSCs緊密粘附，部分細(xì)胞伸到hUCBDSCs下層；在第7天粘附的CD3T細(xì)胞和CD49b NK細(xì)胞均明顯少于第3天。 3.成功構(gòu)建HLA半相合造血干細(xì)胞移植小鼠GVHD模型。 4.hUCBDSCs促進(jìn)HLA半相合造血干

12、細(xì)胞移植小鼠造血重建。 5.hUCBDSCs對(duì)HLA半相合移植小鼠GVHD的調(diào)節(jié)作用：hUCBDSCs明顯降低小鼠的死亡率，延長(zhǎng)其生存期(p<0.05)；組織病理學(xué)評(píng)分及GVHD臨床積分均顯示聯(lián)合hUCBDSCs移植組小鼠GVHD發(fā)生程度明顯低于單純BMT組(p<0.05)；聯(lián)合hUCBDSCs移植明顯促進(jìn)受體小鼠外周血中IL-4表達(dá)，抑制IFN-γ表達(dá)(p<0.05)；聯(lián)合hUCBDSCs移植增加受體小鼠脾臟CD49b NK細(xì)

13、胞、降低CD3 T細(xì)胞及粘附分子CD49d的表達(dá)(p<0.05)；聯(lián)合hUCBDSCs移植明顯降低GVHD靶器官粘附分子CD49d(VLA-4)的表達(dá)(p<0.05)。 6.CM-Dil標(biāo)記的hUCBDSCs早期在HLA半相合造血干細(xì)胞移植小鼠的大多數(shù)器官中表達(dá)，其后主要在骨髓、免疫器官脾臟及皮膚、肝臟及小腸等GVHD主要靶器官中持續(xù)表達(dá)，而在其它器官中，表達(dá)逐漸減弱，甚至消失。 三、結(jié)論 1.在本實(shí)驗(yàn)條件下，改