人臍血源基質(zhì)細胞及骨髓基質(zhì)細胞對造血功能損傷修復作用的比較.pdf

1、研究背景:
　　造血微環(huán)境作為造血干細胞重要的生存環(huán)境,對造血干細胞的生長、成熟和分化發(fā)揮著重要作用。腫瘤患者化/放療后的造血功能損傷嚴重影響患者的治療進程,究其原因除造血干細胞受損外,造血微環(huán)境損傷比造血實質(zhì)細胞損傷導致的造血功能障礙可能更加持久甚至不可逆轉(zhuǎn),這已成為臨床上束縛腫瘤患者接受后續(xù)治療的主要限制性因素。研究發(fā)現(xiàn):輸注人骨髓基質(zhì)細胞(humanbonemarrowstromalcells,hBMSCs)能夠促進造血損傷

2、的恢復和減輕移植后GVHD發(fā)生,提高移植成功率。但hBMSCs存在著來源受限,采集供者骨髓過程比較繁瑣和痛苦且存在風險,細胞數(shù)量及增殖分化能力受供者年齡影響等缺點。此外,許多患者自身就存在著骨髓基質(zhì)細胞功能的異常,這大大降低了自體輸注骨髓基質(zhì)細胞的可行性;如果采用異體移植亦有可能面對組織相容性問題,因此限制了hBMSCs在臨床上的廣泛使用。
　　人臍血源基質(zhì)細胞(humanumbilicalcordbloodderivedstro

3、malcells,hUCBDSCs)是我室培養(yǎng)建立的新型基質(zhì)細胞,前期研究證實其在體外能有效支持造血干/祖細胞增殖,特別是在促進巨核系集落形成方面具有優(yōu)勢作用。而hUCBDSCs與骨髓基質(zhì)細胞相比較,其對造血損傷的修復作用有何差別是需要探討的課題。本研究通過動物實驗比較兩種不同來源的基質(zhì)細胞在修復小鼠造血功能損傷方面的作用,旨在進一步驗證hUCBDSCs的臨床應(yīng)用價值。
　　一、本研究的主要內(nèi)容和研究方法如下
　　1.培養(yǎng)人

4、臍血源基質(zhì)細胞及骨髓基質(zhì)細胞,并采用細胞化學和免疫細胞化學對兩種細胞組成進行鑒定,探討改良臍血基質(zhì)細胞傳代培養(yǎng)的條件和方法。
　　2.給予BALB/c小鼠6.0Gy6oCo射線全身照射,觀察小鼠生存期及1d、3d、5d、7d、14d、21d血象變化,構(gòu)建造血微環(huán)境功能損傷動物模型。
　　3.人臍血源基質(zhì)細胞及人骨髓基質(zhì)細胞輸注造血微環(huán)境損傷動物模型,檢測觀察血常規(guī)、骨髓象、集落形成單位等造血修復相關(guān)指標,比較兩種不同來源基質(zhì)

5、細胞對造血損傷的修復作用。
　　二、實驗結(jié)果如下:
　　1.人臍血基質(zhì)細胞和人骨髓基質(zhì)細胞的培養(yǎng)及鑒定:
　　1)人臍血源基質(zhì)細胞具有以下形態(tài)學特點:①成分不均一,可見“成纖維樣”細胞;“巨噬樣”細胞,“小圓樣”細胞。②細胞化學提示糖原強陽性,陽性率100％;免疫細胞化學顯示:CD106呈陽性;CD44陽性;Fn陽性;CD50呈陽性,CD45陰性。2)骨髓基質(zhì)細胞的特點:①成分較均一,剛接種時可呈集落生長,約3天后細胞

6、開始呈梭形,10天后集落消失,大部分細胞呈梭形,且生長周期較人臍血源基質(zhì)細胞短。
　　2.人臍血基質(zhì)細胞與骨髓基質(zhì)細胞的傳代培養(yǎng):兩種細胞均在70%-80%融合時開始進行傳代,培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件不變,人臍血基質(zhì)細胞采取1:1的比例,骨髓基質(zhì)細胞采取1:3傳入相同容積的培養(yǎng)瓶中。人臍血基質(zhì)細胞隨著傳代次數(shù)越多,細胞形態(tài)趨于一致,以“成纖維樣”細胞,形態(tài)上主要以梭形細胞為主,其余兩種細胞數(shù)量明顯減少。骨髓基質(zhì)細胞細胞在原代時就以梭形細胞

7、為主,隨著傳代的次數(shù)增多,細胞形態(tài)變化不大。
　　3.造血功能損傷動物模型的建立:將10只BALB/c小鼠以6.0Gy6oCo射線全身照射,10只小鼠無死亡,血象中WBC、Plt、RBC均在5d降至最低,而HB則在7d時最低,RBC、HB在21d時恢復至照射前水平,WBC及Plt則在21d恢復水平低于照射前。造血損傷動物模型建立。
　　3.人臍血基質(zhì)細胞和人骨髓基質(zhì)細胞對造血損傷修復作用的比較研究:①對照組在3d時WBC下降

8、,10d開始回升,21d時未能恢復至照射前水平,hUCBDSCs組及hBMSCs組波動情況同對照組,不同的是21d時兩組恢復接近照射前水平,但hUCBDSCs組要優(yōu)于hBMSCs組(P<0.05)。②對照組在10d時Plt降至最低,之后開始緩慢恢復,21d時無法恢復至照射前水平。hUCBDSCs組7d時降至最低,之后開始恢復,21d時恢復;hBMSCs組3d時最低,10d后開始恢復,21d恢復。hUCBDSCs組較其他兩組降低程度最輕(

9、P<0.05),且恢復速度優(yōu)于hBMSCs組和對照組(P<0.05)。③三組均在3d時RBC降至最低,10d后開始恢復,實驗組優(yōu)于對照組(P<0.05),兩組實驗組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。④骨髓象中7d時hUCBDSCs組及hBMSCs組移植后均有輕度骨髓抑制,21d實驗組均骨髓有核細胞增生活躍,紅系恢復情況不佳;與此同時對照組骨髓增生降低,有核細胞減少,③集落培養(yǎng)CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMM三組均是在

10、7d時最低,21d時最高,但hUCBDSCs組移植后7d、14d、21d,所有集落均優(yōu)于其他兩組(P<0.05)且骨髓抑制程度輕,所有小鼠均存活。
　　三、研究得出以下結(jié)論:
　　1.人臍血源基質(zhì)細胞具備造血基質(zhì)細胞的基本生物學特點;
　　2.在本實驗條件下,人臍血基質(zhì)細胞與骨髓基質(zhì)細胞均具有修復造血功能損傷的作用;
　　3.對于造血損傷的修復作用,人臍血基質(zhì)細胞促白細胞、血小板恢復作用要明顯優(yōu)于hBMSC;