單倍體相合造血干細(xì)胞移植后T細(xì)胞免疫重建規(guī)律的初步研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是白血病、淋巴瘤和重型再生障礙性貧血等血液系統(tǒng)疾病的有效治療方法。然而,由于供受者之間嚴(yán)格的人類組織相容性抗原(human leukocyte antigen,HLA)的限制,不足30％患者可以接受HLA相合HSCT。然而,單倍體相合造血干細(xì)胞移植(Haplo-identical HSCT,Haplo-H

2、SCT)則適用于幾乎所有患者。
　　自1983年P(guān)owles等首次報(bào)告Haplo-HSCT以來(lái),血液學(xué)家對(duì)這種新的移植方式進(jìn)行了初步的臨床研究。但是,早期的臨床試驗(yàn)是不成功的,多數(shù)患者死于移植排斥和重度移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)。近幾年,人們對(duì)Haplo-HSCT的方案進(jìn)行了改良和完善,使Haplo-HSCT兩年無(wú)病存活率接近HLA相合HSCT,也使我國(guó)Haplo-HSCT處于國(guó)

3、際領(lǐng)先水平。我們?cè)趪?guó)內(nèi)較早開展了Haplo-HSCT,建立了比較成熟的預(yù)處理和GVHD預(yù)防方案,取得了較好的效果。
　　然而,Haplo-HSCT后免疫重建嚴(yán)重遲緩,持續(xù)的細(xì)胞免疫功能低下,導(dǎo)致感染和復(fù)發(fā),已成為移植后患者主要死亡原因。
　　由于T細(xì)胞既是細(xì)胞免疫的重要參與者,又是體液免疫的調(diào)節(jié)者,因此T細(xì)胞免疫重建最受關(guān)注。其重建主要有兩條途徑:
　　(1)外周途徑:移植物中的T細(xì)胞在外周免疫器官內(nèi)快速擴(kuò)增,這種方式

4、不依賴胸腺功能;
　　(2)胸腺依賴途徑:T淋巴祖細(xì)胞遷徙至胸腺,在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟,產(chǎn)生具有多樣性T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)的初始T淋巴細(xì)胞(naive T lymphocyte,naive T,初始T細(xì)胞),形成穩(wěn)定持久的免疫重建。然而,為預(yù)防急性GVHD的發(fā)生,Haplo-HSCT常采用體外去除移植物中T細(xì)胞,或受者靜脈輸注抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白(anti-thymocyte globuline,AT

5、G)以內(nèi)源性去除T淋巴細(xì)胞,T細(xì)胞免疫重建更多依賴第二條途徑。
　　近幾年,隨著分子及細(xì)胞免疫學(xué)的發(fā)展,產(chǎn)生了一些新的免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)方法,如通過(guò)T細(xì)胞受體切除環(huán)(T-cell receptor excision circle,TREC)數(shù)量和T細(xì)胞受體β鏈可變區(qū)(T-cell receptor β chain variable region,TCRVβ)多樣性來(lái)評(píng)估胸腺輸出功能,通過(guò)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的ATP數(shù)量(ImmuKnow

6、技術(shù))評(píng)價(jià)T細(xì)胞總體功能等,這些方法已經(jīng)實(shí)體器官移植中得以應(yīng)用;同時(shí),也有一些涉及HSCT的報(bào)告相繼發(fā)表。
　　盡管人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到Haplo-HSCT免疫重建的重要性,但是,有關(guān)T細(xì)胞免疫重建的規(guī)律及其影響因素等,系統(tǒng)的報(bào)道卻不多。本研究對(duì)在我院接受Haplo-HSCT的31例患者,選用我們通用的預(yù)處理方案和aGVHD預(yù)防措施,初步分析其移植后的造血植入情況,移植后6個(gè)月內(nèi)aGVHD、感染及復(fù)發(fā)情況;并系統(tǒng)觀察Haplo-HSCT

7、前及移植后6個(gè)月內(nèi)T細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù)量的變化及sjTREC數(shù)量、TCR-Vβ多樣性、CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生ATP數(shù)量,結(jié)合臨床常規(guī)檢查及病例特點(diǎn),初步研究Haplo-HSCT后早期T細(xì)胞免疫重建規(guī)律及指標(biāo)臨床相關(guān)性。本研究可能為指導(dǎo)臨床治療的諸多細(xì)節(jié),如免疫抑制劑的增減,移植后供者淋巴細(xì)胞輸注(donor lymphocyte infusion,DLI)等提供一定的參考。
　　研究方法：
　　1、以臨床常規(guī)使用的微量序列特異引物聚

8、合酶鏈反應(yīng)(sequence-specific primers PCR,PCR-SSP)技術(shù)進(jìn)行HLA分型。
　　2、對(duì)于31例接受Haplo-HSCT的患者,采用我院常規(guī)的預(yù)處理和GVHD預(yù)防方案,選用G-CSF動(dòng)員后的外周血和骨髓作為干細(xì)胞來(lái)源。
　　3、細(xì)胞標(biāo)記分析:采用流式細(xì)胞術(shù)分析的方法,進(jìn)行相關(guān)表面抗原及胞漿抗原陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)。選用適宜的FITC,PE,APC或PerCP標(biāo)記的單克隆抗體標(biāo)記細(xì)胞,監(jiān)測(cè)移植物中CD3

9、4+細(xì)胞比例,移植前后患者外周血中T細(xì)胞亞群比例,并根據(jù)血細(xì)胞分析中白細(xì)胞總數(shù)計(jì)算出T細(xì)胞各亞群細(xì)胞數(shù)絕對(duì)值。造血干/祖細(xì)胞標(biāo)記為CD34+,初始T細(xì)胞的判定指標(biāo)為CD4+/或CD8+/CD45RA+/CD62L+細(xì)胞;記憶T淋巴細(xì)胞(memory T lymphocyte,memory T,記憶T細(xì)胞)標(biāo)記為CD4+/CD45RO+或CD8+/CD45RO+。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)標(biāo)記為CD4+/

10、CD25+/FOXP3+。
　　4、sjTREC測(cè)定:取病人外周血,密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),提取基因組DNA。采用文獻(xiàn)報(bào)道的引物,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)患者信號(hào)結(jié)合T細(xì)胞受體刪除環(huán)(signal-joint TRECs,sjTREC),了解患者胸腺輸出功能。
　　5、T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)譜系分析:取病人外

11、周血,密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞,提取RNA。對(duì)于移植中出現(xiàn)aGVHD的6例患者,應(yīng)用RT-RCR的方法擴(kuò)增其移植前及移植后1個(gè)月、3個(gè)月的TCRVβ24個(gè)亞家族的序列,并通過(guò)基因掃描的方法了解其亞家族的克隆表達(dá)情況。
　　6、CD4+T細(xì)胞總體功能分析:采用ImmuKnow方法,按照試劑盒提供的步驟,免疫磁珠分離CD4+T細(xì)胞后,用植物血凝素(phytohem agglutinin,PHA)刺激,18小時(shí)后裂解細(xì)胞,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)A

12、TP含量,以評(píng)估T細(xì)胞總體功能。依據(jù)ATP含量,將免疫反應(yīng)分為高度(>525ng/mL)、中度(226–524ng/mL)和低度(<225ng/mL)三個(gè)水平。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SPSS.18軟件進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　研究結(jié)果：
　　1、我們采用的靜脈輸注ATG體內(nèi)去除T細(xì)胞的Haplo-HSCT方式,31例患者均未發(fā)生排斥。31例患者粒細(xì)胞植入中位時(shí)間

13、為(17.16±4.75)d,27例患者血小板植入中位時(shí)間為(30.59±18.05)d,3例高危和1例標(biāo)?；颊咧了劳鲅“迦晕粗踩?移植后100天內(nèi)發(fā)生Ⅱ~Ⅳ度aGVHD13例(42%),其中Ⅲ~Ⅳ度3例(9.7%);移植后早期31例患者均有不同程度的感染,肺部感染13例(42%);31患者中死亡12人,其中7例死于復(fù)發(fā),2例死于感染,2例死于急性GVHD。
　　2、移植前CD3+T細(xì)胞數(shù)為710±286.51/μL,移植后1個(gè)

14、月降至372.85±313.52/μL,3個(gè)月升為1071.36±664.30/μL,6個(gè)月升至1393.32±857.89/μL。移植前CD4+T細(xì)胞數(shù)為277.24±124.49/μL,移植后1個(gè)月降至57.67±49.11/μL,3個(gè)月時(shí)升為178.04±148.93/μL,6個(gè)月升至210.19±130.74/μL;移植前CD8+T細(xì)胞平均值為396.36±210.23/μL,移植后1個(gè)月降至258.87±229.65/μL,3

15、個(gè)月升為701.73±492.82/μL,6個(gè)月為升至879.11±566.40/μL;移植前CD4+CD45RA+CD62L+T細(xì)胞數(shù)為55.261±44.17/μL,移植后1個(gè)月降至1.95±2.72/μL,移植后3個(gè)月上升為4.69±5.62/μL,6個(gè)月升至23.08±37.04/μL;移植前CD8+CD45RA+CD62L+T細(xì)胞數(shù)為135.74±42.31/μL,移植后1個(gè)月為降至15.95±16.90/μL,3個(gè)月開始上升

16、為70.57±47.61/μL,6個(gè)月升至176.09±222.18/μL。移植前CD4+CD45RO+T細(xì)胞數(shù)為203.61±101.44/μL,移植后1個(gè)月為46.56±42.08/μL,3個(gè)月為171.67±141.64/μL,6個(gè)月升至176.73±104.53/μL;移植前CD8+CD45RO+T細(xì)胞數(shù)為165.94±102.67/μL,移植后1個(gè)月為177.10±167.71/μL,3個(gè)月為523.23±415.34/μL,

17、6個(gè)月升至437.63±410.09/μL;CD4+CD25+FOXP3+T細(xì)胞數(shù)為18.34±10.32/μL,移植后1個(gè)月為2.44±2.16/μL,3個(gè)月為9.84±11.12/μL,6個(gè)月為9.96±9.26/μL。
　　3、發(fā)生aGVHD組在監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)CD4+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)略高于無(wú)aGVHD組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;發(fā)生aGVHD組記憶T細(xì)胞和初始T細(xì)胞數(shù)高于無(wú)aGVHD組,但僅在移植后1個(gè)月時(shí)CD8+記憶T和CD8

18、+初始T細(xì)胞間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。移植后1個(gè)月時(shí),無(wú)aGVHD組Treg細(xì)胞數(shù)高于aGVHD組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0097)。
　　4、22例接受Haplo-HSCT的患者移植前外周血sjTREC水平為78.72149±135.0016拷貝/105PBMC,8例供者為699.4644±1221.6469拷貝/105PBMC,兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。22例患者移植后1個(gè)月sjTREC水平為20.0129±2

19、6.700拷貝/105PBMC,3個(gè)月為25.4031±29.7042拷貝/105PBMCs,6個(gè)月為21.5883±17.4021拷貝/105PBMC?；颊咭浦睬巴庵苎猻jTREC水平與移植后6個(gè)月內(nèi)sjTREC水平無(wú)明顯相關(guān),Spearman相關(guān)系數(shù)分別為:0.278,0.467,0.714;相應(yīng)的P值分別為:0.279,0.205,0.111。有aGVHD組與無(wú)aGHVD組移植后早期外周血sjTREC水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.

20、05)。
　　5、1例健康供者TCRVβ24個(gè)亞家族的基因掃描圖示亞家族完整、圖型分布多符合高斯分布;6例患者移植前有較多的亞家族缺失,存在的亞家族譜系形態(tài)也不是高斯分布,較多出現(xiàn)雙峰和寡克隆。患者移植后寡克隆比率呈逐漸增高趨勢(shì)。
　　6、25例患者Haplo-HSCT前CD4+T細(xì)胞ATP含量為210.44±94.71ng/mL,移植后1個(gè)月降至181.87±121.63ng/mL,其后逐漸恢復(fù),移植后3個(gè)月恢復(fù)至正常水平

21、,為274.51±119.31ng/mL,移植后6個(gè)月升至336.50±98.63ng/mL。移植后發(fā)生肺部感染組的ATP值在移植前已經(jīng)低于無(wú)肺部感染組,在移植后不同時(shí)間點(diǎn)也低于未發(fā)生感染者;發(fā)生aGVHD者在移植前的ATP值已經(jīng)高于無(wú)aGVHD組,在移植后不同時(shí)間點(diǎn)也高于未發(fā)生aGVHD者;復(fù)發(fā)組在移植前和移植后不同時(shí)間組的ATP值均低于未復(fù)發(fā)組。
　　結(jié)論：
　　1、我們采用的靜脈輸注ATG體內(nèi)去除T細(xì)胞,G-CSF動(dòng)員

22、的骨髓和外周血干細(xì)胞聯(lián)合移植的單倍體相合造血干細(xì)胞移植的方式,無(wú)一例排斥,安全可行。aGVHD發(fā)生率與國(guó)內(nèi)同行報(bào)道相似,復(fù)發(fā)感染是其主要死亡原因。
　　2、Haplo-HSCT術(shù)后CD8+T細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)早于CD4+T細(xì)胞;記憶T細(xì)胞重建早于初始T細(xì)胞,尤其是CD4+初始T細(xì)胞,在移植后6個(gè)月時(shí)仍未恢復(fù)。Treg細(xì)胞數(shù)在Haplo-HSCT后恢復(fù)緩慢,移植后6個(gè)月時(shí)才僅恢復(fù)至移植前50%左右。aGVHD對(duì)移植后早期CD4+T和CD8

23、+T細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯影響。Treg可能會(huì)抑制aGVHD的發(fā)生。
　　3、Haplo-HSCT前患者的胸腺輸出功能已經(jīng)受損,在移植后6個(gè)月,胸腺功能仍未恢復(fù)。aGHVD對(duì)移植后早期的外周血sjTREC水平無(wú)明顯影響。
　　4、Haplo-HSCT前患者即存在TCRβV亞家族缺失和寡克隆,提示移植前患者處于免疫病理狀態(tài);6例發(fā)生aGVHD的患者,Haplo-HSCT后均存在亞家族的缺失和寡克隆的表達(dá),且其寡克隆比率較移植前增高?？赡?/p>

24、與移植后時(shí)間較短,患者胸腺依賴途徑的T細(xì)胞尚未免疫重建有關(guān);也可能與aGVHD的發(fā)生及其治療用了大劑量免疫抑制劑有關(guān)。
　　5、Haplo-HSCT后1個(gè)月時(shí)患者CD4+T細(xì)胞功能下降,移植后3個(gè)月時(shí)恢復(fù)正常;Haplo-HSCT后發(fā)生肺部感染和復(fù)發(fā)組病例的CD4+T細(xì)胞功能,在移植前后均低于無(wú)感染和復(fù)發(fā)組;而發(fā)生aGVHD組的ATP值在移植前后不同時(shí)間點(diǎn)均高于無(wú)aGVHD組。提示CD4+T細(xì)胞功能有可能預(yù)測(cè)感染復(fù)發(fā)及aGVHD的