miRNA-101在幼鼠梗阻腎臟中的表達(dá)及其與腎間質(zhì)纖維化的相關(guān)性研究.pdf

1、背景
　　先天性輸尿管梗阻導(dǎo)致的患兒腎積水臨床常見，約占1-2％，且隨著梗阻時(shí)間的延長，腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞萎縮、壞死，大量膠原纖維沉積，腎間質(zhì)纖維化程度不斷加重，腎臟功能也將進(jìn)一步降低。梗阻纖維化發(fā)生的機(jī)制仍不清楚。臨床上也無腎間質(zhì)纖維化治療的有效方法。微小RNA(miRNA)作為一種非編碼的小分子RNA片段，多種研究證實(shí)其廣泛參與轉(zhuǎn)錄后基因水平的調(diào)控與表達(dá)，對細(xì)胞的分化、增殖、胚胎發(fā)育、生物體內(nèi)信號傳導(dǎo)及臨床相關(guān)疾病早期診斷、治療及預(yù)后

2、有積極的作用。丹麥制藥公司已將LNA-antimiRNA-122用于第一階段臨床試驗(yàn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死部位及其周圍心肌細(xì)胞miRNA-101表達(dá)降低，然而，利用細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miRNA-101則能抑制新生鼠成纖維細(xì)胞膠原產(chǎn)生和增殖，阻止了心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化的發(fā)生。是否miRNA-101也參與了腎間質(zhì)纖維化尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立單側(cè)輸尿管完全梗阻(CUUO)模型來探討腎臟miRNA-101表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展的關(guān)系，為探索腎間質(zhì)纖維

3、化新的治療方法提供參考。
　　方法
　　選取30只SD雄性幼鼠，年齡（8±1）周，體重(180±20)g，隨機(jī)分為sham組、CUUO7d組和14d組。以10％水合氯醛0.4ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉幼鼠，備皮，固定，消毒鋪巾后，取其腹正中切口打開腹腔，用棉簽將腸管推至右側(cè)，暴露左側(cè)輸尿管，在腎靜脈及腰靜脈之間游離輸尿管并完全結(jié)扎，逐層縫合至皮膚，再次消毒包扎后放入恒溫箱。分別于梗阻后7d和14d處死取其左側(cè)腎臟，將其切開分為

4、均等的兩部分，一部分用于RT-PCR，采用相對定量法檢測不同梗阻時(shí)間段梗阻側(cè)腎臟中miRNA-101表達(dá)。另一部分用于Westernblot及HE、免疫組織化學(xué)檢測α-SMA、E-cadherin的相對定量及定性表達(dá)。
　　結(jié)果
　　免疫組織化學(xué)測定結(jié)果顯示α-SMA及E-cadherin主要表達(dá)于腎間質(zhì)，呈棕黃色，其中α-SMA和E-cadherin在CUUO14d組、CUUO7d組及sham組顯色依次遞減和增強(qiáng);組織學(xué)上

5、可見CUUO7d組及14d組腎小管管腔增大，明顯不同于sham組。RT-PCR結(jié)果顯示miRNA-101相對表達(dá)量（folddifference）sham組是CUUO14d組的(14.50±5.12)倍，CUUO7d組是14d組的(3.45±2.27)倍，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);westernblot顯示梗阻側(cè)腎臟α-SMA在CUUO14d組、CUUO7d和sham表達(dá)分別為1.22±0.48、0.50±0.06和0.2

6、1±0.03，與相應(yīng)時(shí)間段miRNA-101表達(dá)成負(fù)相關(guān)（r=-0.74，P＜0.05）。相反，E-cadherin在CUUO14d組、CUUO7d和sham表達(dá)分別為0.24±0.22、0.50±0.44和0.76±0.20，與相應(yīng)時(shí)間段miRNA-101表達(dá)成正相關(guān)（r=0.88，P＜0.05）。
　　結(jié)論
　　幼鼠完全梗阻腎臟miRNA-101表達(dá)隨著梗阻時(shí)間的延長而下降，與反映腎臟間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度的相關(guān)蛋白表達(dá)相關(guān)