DJ-1在腎間質纖維化中的表達及其作用機制.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：腎間質纖維化中DJ-1及PTEN的表達與細胞定位
　　 目的：觀察DJ-1及PTEN在腎間質纖維化中的表達和細胞定位。
　　 方法：體外10ng/ml TGF-β1刺激72h誘導人腎小管上皮細胞(HKC)轉分化；Western 印記法檢測正常組和TGF-β1干預組細胞內(nèi)E-cadherin、vimentin、DJ-1和PTEN蛋白表達；RT-PCR法檢測兩組細胞內(nèi)DJ-1和PT

2、EN mRNA表達；應用激光共聚焦顯微鏡觀察DJ-1和PTEN在兩組細胞內(nèi)定位。體內(nèi)以5/6腎切除法制作大鼠慢性腎纖維化模型；Masson染色檢測腎組織纖維化水平；免疫組化法檢測腎組織內(nèi)DJ-1和PTEN蛋白的表達和分布。
　　 結果：體外 TGF-β1干預組較正常組細胞內(nèi)E-cadherin和PTEN蛋白表達下降(p<0.05)，而vimentin、DJ-1蛋白表達升高(p<0.05)； DJ-1 mRNA表達在TGF-β1干

3、預組較正常組升高(p<0.05)，而PTEN mRNA表達下降(p<0.05)；正常組HKC細胞內(nèi)PTEN和DJ-1在細胞漿和細胞核均有表達，經(jīng)TGF-β1干預后，DJ-1在細胞漿和細胞核表達均明顯增加，且細胞核內(nèi)增加更明顯；TGF-β1干預組細胞漿內(nèi)幾乎不表達PTEN，而細胞核內(nèi)PTEN表達較正常組略增加。體內(nèi)5/6腎切除組較假手術組大鼠腎組織間質纖維化明顯增加(p<0.05)，DJ-1蛋白表達升高而PTEN蛋白表達下降(p<0.05

4、)。
　　 結論：腎間質纖維化中DJ-1表達升高而PTEN表達下降；轉分化腎小管上皮細胞DJ-1在細胞漿和細胞核內(nèi)表達均增加，且細胞核增加更明顯；PTEN在轉分化腎小管上皮細胞的細胞漿內(nèi)表達明顯下降，而細胞核內(nèi)略有增加。
　　 第二部分：DJ-1對PTEN表達、PI3K/Akt通路活化及腎小管上皮細胞轉分化的影響
　　 目的：研究上調(diào)DJ-1對PTEN表達、PI3K/Akt通路活化及腎小管上皮細胞轉分化的影響。<

5、br>　　 方法：脂質體介導含人全長DJ-1基因或空載體轉染HKC細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達，Western 印記法檢測正常組、DJ-1基因轉染組和空載體轉染組細胞內(nèi)DJ-1、PTEN、E-cadherin和vimentin蛋白表達及β-catenin酪氨酸磷酸化水平；RT-PCR法檢測各組內(nèi)PTEN mRNA表達。DJ-1基因轉染前1h用PI3K抑制劑LY294002預處理，Western 印記法檢測正常組、DJ-1

6、基因轉染組、空載體轉染組和LY294002+DJ-1轉染組p-Akt和Akt蛋白表達。應用激光共聚焦顯微鏡觀察正常組、DJ-1基因轉染組和TGF-β1干預組細胞內(nèi)PTEN的分布。
　　 結果：DJ-1基因轉染組細胞較正常組DJ-1、vimentin蛋白表達和β-catenin酪氨酸磷酸化水平明顯增加(p<0.05)，而E-cadherin、PTEN蛋白及PTEN mRNA表達均下降(p<0.05)。DJ-1基因轉染組較正常組p-

7、Akt表達升高(p<0.05)，但經(jīng)LY294002預處理組與正常組表達基本一致(p>0.05)。正常組細胞內(nèi)PTEN分布于細胞核和細胞漿，而DJ-1基因轉染組僅細胞核內(nèi)有PTEN分布，這與TGF-β1干預組基本一致。
　　 結論：高表達DJ-1可抑制PTEN表達，并促進PI3K/Akt通路活化，導致腎小管上皮細胞轉分化。
　　 第三部分：PTEN對腎小管上皮細胞轉分化的抑制及其機制研究
　　 目的：研究PTEN

8、 高表達對腎小管上皮細胞轉分化的抑制及其信號傳導機制。
　　 方法：脂質體介導含人全長PTEN基因轉染HKC細胞48h，倒置熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白表達；Western 印記法檢測PTEN蛋白；RT-PCR檢測PTEN mRNA表達。將實驗分為正常組、TGF-β1組(給予TGF-β1刺激)、PTEN+TGF-β1組(PTEN基因轉染后給予TGF-β1刺激)、空載體+TGF-β1組(空載體轉染后給予TGF-β1刺激)。Weste

9、rn 印記法檢測各組細胞E-cadherin、vimentin、Akt、p-Akt表達水平。
　　 結果：PTEN基因轉染HKC細胞48 h后可見明顯綠色熒光蛋白表達；PTEN蛋白及PTEN mRNA表達較正常組及空載體轉染組細胞均顯著上升(p<0.05)。在正常組、TGF-β1組、PTEN+TGF-β1組、空載體+TGF-β1組中，TGF-β1組及空載體+TGF-β1組較正常組E-cadherin表達明顯下降(p<0.05)，