DJ-1在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)及其作用機(jī)制.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：腎間質(zhì)纖維化中DJ-1及PTEN的表達(dá)與細(xì)胞定位
　　 目的：觀察DJ-1及PTEN在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)和細(xì)胞定位。
　　 方法：體外10ng/ml TGF-β1刺激72h誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞(HKC)轉(zhuǎn)分化；Western 印記法檢測正常組和TGF-β1干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、vimentin、DJ-1和PTEN蛋白表達(dá)；RT-PCR法檢測兩組細(xì)胞內(nèi)DJ-1和PT

2、EN mRNA表達(dá)；應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察DJ-1和PTEN在兩組細(xì)胞內(nèi)定位。體內(nèi)以5/6腎切除法制作大鼠慢性腎纖維化模型；Masson染色檢測腎組織纖維化水平；免疫組化法檢測腎組織內(nèi)DJ-1和PTEN蛋白的表達(dá)和分布。
　　 結(jié)果：體外 TGF-β1干預(yù)組較正常組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin和PTEN蛋白表達(dá)下降(p<0.05)，而vimentin、DJ-1蛋白表達(dá)升高(p<0.05)； DJ-1 mRNA表達(dá)在TGF-β1干

3、預(yù)組較正常組升高(p<0.05)，而PTEN mRNA表達(dá)下降(p<0.05)；正常組HKC細(xì)胞內(nèi)PTEN和DJ-1在細(xì)胞漿和細(xì)胞核均有表達(dá)，經(jīng)TGF-β1干預(yù)后，DJ-1在細(xì)胞漿和細(xì)胞核表達(dá)均明顯增加，且細(xì)胞核內(nèi)增加更明顯；TGF-β1干預(yù)組細(xì)胞漿內(nèi)幾乎不表達(dá)PTEN，而細(xì)胞核內(nèi)PTEN表達(dá)較正常組略增加。體內(nèi)5/6腎切除組較假手術(shù)組大鼠腎組織間質(zhì)纖維化明顯增加(p<0.05)，DJ-1蛋白表達(dá)升高而PTEN蛋白表達(dá)下降(p<0.05

4、)。
　　 結(jié)論：腎間質(zhì)纖維化中DJ-1表達(dá)升高而PTEN表達(dá)下降；轉(zhuǎn)分化腎小管上皮細(xì)胞DJ-1在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)均增加，且細(xì)胞核增加更明顯；PTEN在轉(zhuǎn)分化腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)明顯下降，而細(xì)胞核內(nèi)略有增加。
　　 第二部分：DJ-1對PTEN表達(dá)、PI3K/Akt通路活化及腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響
　　 目的：研究上調(diào)DJ-1對PTEN表達(dá)、PI3K/Akt通路活化及腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。<

5、br>　　 方法：脂質(zhì)體介導(dǎo)含人全長DJ-1基因或空載體轉(zhuǎn)染HKC細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，Western 印記法檢測正常組、DJ-1基因轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)DJ-1、PTEN、E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)及β-catenin酪氨酸磷酸化水平；RT-PCR法檢測各組內(nèi)PTEN mRNA表達(dá)。DJ-1基因轉(zhuǎn)染前1h用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理，Western 印記法檢測正常組、DJ-1

6、基因轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組和LY294002+DJ-1轉(zhuǎn)染組p-Akt和Akt蛋白表達(dá)。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察正常組、DJ-1基因轉(zhuǎn)染組和TGF-β1干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)PTEN的分布。
　　 結(jié)果：DJ-1基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞較正常組DJ-1、vimentin蛋白表達(dá)和β-catenin酪氨酸磷酸化水平明顯增加(p<0.05)，而E-cadherin、PTEN蛋白及PTEN mRNA表達(dá)均下降(p<0.05)。DJ-1基因轉(zhuǎn)染組較正常組p-

7、Akt表達(dá)升高(p<0.05)，但經(jīng)LY294002預(yù)處理組與正常組表達(dá)基本一致(p>0.05)。正常組細(xì)胞內(nèi)PTEN分布于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，而DJ-1基因轉(zhuǎn)染組僅細(xì)胞核內(nèi)有PTEN分布，這與TGF-β1干預(yù)組基本一致。
　　 結(jié)論：高表達(dá)DJ-1可抑制PTEN表達(dá)，并促進(jìn)PI3K/Akt通路活化，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。
　　 第三部分：PTEN對腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的抑制及其機(jī)制研究
　　 目的：研究PTEN

8、 高表達(dá)對腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的抑制及其信號傳導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：脂質(zhì)體介導(dǎo)含人全長PTEN基因轉(zhuǎn)染HKC細(xì)胞48h，倒置熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白表達(dá)；Western 印記法檢測PTEN蛋白；RT-PCR檢測PTEN mRNA表達(dá)。將實(shí)驗(yàn)分為正常組、TGF-β1組(給予TGF-β1刺激)、PTEN+TGF-β1組(PTEN基因轉(zhuǎn)染后給予TGF-β1刺激)、空載體+TGF-β1組(空載體轉(zhuǎn)染后給予TGF-β1刺激)。Weste

9、rn 印記法檢測各組細(xì)胞E-cadherin、vimentin、Akt、p-Akt表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：PTEN基因轉(zhuǎn)染HKC細(xì)胞48 h后可見明顯綠色熒光蛋白表達(dá)；PTEN蛋白及PTEN mRNA表達(dá)較正常組及空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均顯著上升(p<0.05)。在正常組、TGF-β1組、PTEN+TGF-β1組、空載體+TGF-β1組中，TGF-β1組及空載體+TGF-β1組較正常組E-cadherin表達(dá)明顯下降(p<0.05)，