miRNA-9在低氧誘導的腎臟纖維化中的作用研究.pdf

1、目前世界上有超過5億人患有慢性腎臟疾病，并且每年超過百萬人死于慢性腎臟病導致的心腦血管并發(fā)癥。所以，目前慢性腎臟病成為繼心腦血管病、腫瘤、糖尿病之后又一個威脅人類健康的疾病，從而成為全球性公共衛(wèi)生問題。腎臟纖維化是慢性腎臟病的共同特征，也是進展至終末期腎病的共同病理過程。所以，研究腎臟纖維化的機制意義重大。
　　miRNA是近年來的研究熱點，其中miRNA-9在腫瘤的EMT、組織及器官的纖維化中發(fā)揮重要的作用。既往研究顯示組織缺氧

2、能夠促進細胞EMT，并且能夠促進腫瘤的浸潤及轉移。除此之外，低氧亦在腎臟EMT及纖維化中發(fā)揮著舉足重輕的作用。那么，miRNA-9在低氧誘導的腎臟纖維化中是否發(fā)揮一定的作用？
　　E-cadherin是一種由CDH1基因編碼的細胞表面糖蛋白。其能夠調節(jié)鈣依賴的細胞間連接，并且參與細胞的分化及形態(tài)改變。但是其在腎臟纖維化中研究較少。通過生物信息學預測，我們發(fā)現(xiàn)CDH1可能是miRNA-9的靶基因之一。那么，E-cadherin是否參

3、與低氧誘導的腎臟纖維化呢？它與miRNA-9存在著怎樣的關系呢?對上述問題目前仍不清楚。
　　目的：
　　1.研究HK-2細胞在低氧刺激后，miRNA-9、E-cadherin、纖維化分子的表達情況；
　　2.研究miRNA-9在HK-2細胞表型轉換中的作用；
　　3.研究E-cadherin在HK-2細胞表型轉換中的作用；
　　4.研究miRNA-9與E-cadherin之間的關系；
　　5.研究m

4、iRNA-9、E-cadherin在大鼠UUO模型及IgA腎病中的表達。
　　方法：
　　1.HK-2細胞在低氧孵箱中培養(yǎng)不同時間，通過qRT-PCR和Western blot方法，檢測miRNA-9、E-cadherin和纖維化分子的表達；
　　2.用miRNA-9 mimic和inhibitor分別進行轉染，使miRNA-9過表達和抑制，觀察其在HK-2細胞表型轉換中的作用；
　　3.用E-cadherin慢

5、病毒進行轉染建立過表達細胞系，并用siRNA轉染建立干擾細胞系，觀察轉染后其在HK-2細胞表型轉換中的作用；
　　4.數(shù)據(jù)庫預測miRNA-9的靶基因，并通過雙熒光素酶報告基因證實；
　　5.建立大鼠UUO模型，檢測miRNA-9、E-cadherin在其中的表達；收集臨床IgA腎病病人腎活檢組織、腎癌病人癌旁腎組織，并檢測miRNA-9、E-cadherin在其中的表達。
　　結果：
　　1.HK-2細胞置于1

6、％O2的孵箱中分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h，qRT-PCR及Western blot方法檢測miRNA-9、E-cadherin、纖維化分子的表達，結果顯示：miRNA-9、纖維化分子的表達隨培養(yǎng)時間的延長逐漸升高，E-cadherin逐漸降低。說明低氧刺激可促進HK-2細胞纖維化。
　　2.miRNA-9 mimic、inhibitor分別進行轉染，qRT-PCR及Western blot方法檢測miRNA-9、

7、E-cadherin、纖維化分子的表達，結果顯示：miRNA-9mimic轉染后，纖維化分子的表達增加，E-cadherin表達減少；miRNA-9 inhibitor轉染后，E-cadherin表達增加，纖維化分子的表達減少。說明miRNA-9可促進HK-2細胞向間充質細胞轉化。
　　3.E-cadherin過表達慢病毒轉染后，qRT-PCR及Western blot方法檢測E-cadherin、及纖維化分子的表達，結果顯示：E

8、-cadherin的表達升高，纖維化分子的表達降低；siRNA轉染后，qRT-PCR及Western blot方法檢測E-cadherin、纖維化分子的表達，結果提示：E-cadherin的表達減少，纖維化分子的表達增加。說明E-cadherin可抑制HK-2細胞向間充質細胞轉化。
　　4.Target Scan軟件預測發(fā)現(xiàn)CDH1可能為miRNA-9的下游靶基因之一，雙熒光素酶報告基因證實miRNA-9可以與CDH1的3'UTR

9、相結合。
　　5.在大鼠UUO模型中，miRNA-9的表達明顯升高，E-cadherin的表達顯著下降；與癌旁正常腎組織相比，IgA腎病病人活檢腎組織中，miRNA-9的表達明顯增加，E-cadherin的表達顯著減少。
　　結論：通過研究低氧刺激后的HK-2細胞中、UUO模型中、IgA腎病病人中miRNA-9、E-cadherin的表達，我們發(fā)現(xiàn)低氧刺激后HK-2細胞、UUO模型、IgA腎病病人活檢樣本中miRNA-9的表