FAK在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機制.pdf

1、第一部分:目的：觀察轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor beta 1，TGF-β1）誘導的正常人近端腎小管上皮細胞（HK-2）轉(zhuǎn)分化（epithelial-to-mesenchymAltransition，EMT）過程中黏著斑激酶（FocAladhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達及下調(diào)FAK的表達后對TGF-β1誘導的HK-2細胞轉(zhuǎn)分化進程的影響。方法：應用TGF-β1（10μg/L）刺激HK

2、-2細胞，采用RT-PCR, Western blot和免疫熒光方法分別檢測E-鈣粘蛋白(E-cadherin), α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscleactin, α-SMA），F(xiàn)AK Mrna和蛋白的表達及p-FAK (Tyr397)的蛋白表達。應用Lipofectmine2000將FAK-siRNA 轉(zhuǎn)染HK-2細胞，采用Western blot 觀察下調(diào)表達FAK對上述指標的影響。結(jié)果：TGF-β1刺激后，HK-2

3、細胞E-cadherin蛋白和Mrna表達下調(diào)，α-SMA蛋白和Mrna水平上調(diào)。FAK蛋白和Mrna 隨時間的延長表達逐漸增多，48h 達到高峰。P-FAK (Tyr397)蛋白表達趨勢與FAK 相同。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA后FAK的Mrna和蛋白分別下降了61％和52％，下調(diào)表達FAK后可以顯著抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞α-SMA蛋白的上調(diào)表達；逆轉(zhuǎn)E-cadherin蛋白的下調(diào)表達。結(jié)論：在TGF-β1誘導的HK-2細胞轉(zhuǎn)分

4、化進程中FAK蛋白表達上調(diào)，敲低FAK表達后可以部分減輕轉(zhuǎn)分化的程度，提示FAK在TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化和腎臟纖維化中發(fā)揮一定的作用。
　　
　　 第二部分:目的：探討?zhàn)ぶ呒っ福‵ocAladhesion kinase，F(xiàn)AK）在TGF-β1誘導的HK-2細胞轉(zhuǎn)分化進程中的可能作用機制。方法：應用Lipofectmine2000將FAK-siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細胞，并加入TGF-β1（10μg/L）刺激

5、，采用Western blot和免疫熒光方法分別檢測FAK，E-鈣粘蛋白(E-cadherin), Akt,基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9），金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1），和IV型膠原（collagen IV，COL-IV）的蛋白表達，采用transwell方法檢測細胞遷移率。結(jié)果：（1）TGF-

6、β1刺激后，HK-2細胞FAK蛋白表達逐漸增多, E-cadherin蛋白表達下調(diào)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FAK-siRNA后可以顯著抑制FAK蛋白的增加并逆轉(zhuǎn)E-cadherin蛋白的下調(diào)表達。（2）TGF-β1可以誘導Akt的活化，即磷酸化的Akt 增多，但這種增加趨勢同樣被FAK-siRNA 所抑制。（3） PI3K/Akt的抑制劑LY294002能減輕TGF-β1導致的E-cadherin蛋白的下調(diào)，但不影響FAK的表達。（4）TGF-β1

7、可導致HK-2細胞中MMP-9表達升高，TIMP-1和collagen IV表達下降，轉(zhuǎn)染FAK-siRNA后能減輕這些改變。（5）敲低FAK的表達能顯著抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞的遷移能力。結(jié)論：FAK在TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮非常重要的作用，可通過PI3K/Akt 途徑實現(xiàn)的。
　　
　　 第三部分:目的：觀察黏著斑激酶（FocAlAdhesion Kinase， FAK）在單側(cè)輸尿管梗阻

8、（unilaterAlureterAlobstruction，UUO）大鼠腎間質(zhì)纖維化中的表達，并探討其表達變化的意義。方法：（1）雄性SD大鼠16只隨機分成兩組：假手術(shù)組，單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）組。麻醉后打開腹腔，假手術(shù)組只分離左輸尿管不結(jié)扎，UUO組雙結(jié)扎左側(cè)輸尿管，手術(shù)后14天將各組大鼠處死。（2）生化指標檢測：兩組大鼠處死前取血測血鉀、鈉、肌酐。（3）左側(cè)腎組織行Masson 染色分析判斷腎間質(zhì)纖維化程度。（4）免疫組化染色和

9、Western blot 觀察腎間質(zhì)FAK, E-cadherin，α-SMA的表達，并進行圖像分析探討FAK和E-cadherin表達的相關(guān)性。結(jié)果：（1）兩組血清鈉，鉀無顯著性差異（p>0.05），血肌酐UUO組較假手術(shù)組顯著升高（p<0.05）。（2）Masson 染色示：與假手術(shù)組相比, UUO組大鼠腎小管明顯擴張，腎間質(zhì)膠原纖維增加，纖維化程度明顯增加。（3）UUO組大鼠FAK，α-SMA的表達在腎小球和腎間質(zhì)均顯著升高，而E