FAK在腎間質纖維化中的作用及機制.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分:目的:觀察轉化生長因子β1(Transforming growth factor beta 1,TGF-β1)誘導的正常人近端腎小管上皮細胞(HK-2)轉分化(epithelial-to-mesenchymAltransition,EMT)過程中黏著斑激酶(FocAladhesion kinase,F(xiàn)AK)的表達及下調FAK的表達后對TGF-β1誘導的HK-2細胞轉分化進程的影響。方法:應用TGF-β1(10μg/L)刺激HK

2、-2細胞,采用RT-PCR, Western blot和免疫熒光方法分別檢測E-鈣粘蛋白(E-cadherin), α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscleactin, α-SMA),F(xiàn)AK Mrna和蛋白的表達及p-FAK (Tyr397)的蛋白表達。應用Lipofectmine2000將FAK-siRNA 轉染HK-2細胞,采用Western blot 觀察下調表達FAK對上述指標的影響。結果:TGF-β1刺激后,HK-2

3、細胞E-cadherin蛋白和Mrna表達下調,α-SMA蛋白和Mrna水平上調。FAK蛋白和Mrna 隨時間的延長表達逐漸增多,48h 達到高峰。P-FAK (Tyr397)蛋白表達趨勢與FAK 相同。脂質體轉染siRNA后FAK的Mrna和蛋白分別下降了61%和52%,下調表達FAK后可以顯著抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞α-SMA蛋白的上調表達;逆轉E-cadherin蛋白的下調表達。結論:在TGF-β1誘導的HK-2細胞轉分

4、化進程中FAK蛋白表達上調,敲低FAK表達后可以部分減輕轉分化的程度,提示FAK在TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞轉分化和腎臟纖維化中發(fā)揮一定的作用。
  
   第二部分:目的:探討?zhàn)ぶ呒っ福‵ocAladhesion kinase,F(xiàn)AK)在TGF-β1誘導的HK-2細胞轉分化進程中的可能作用機制。方法:應用Lipofectmine2000將FAK-siRNA轉染HK-2細胞,并加入TGF-β1(10μg/L)刺激

5、,采用Western blot和免疫熒光方法分別檢測FAK,E-鈣粘蛋白(E-cadherin), Akt,基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9),金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1),和IV型膠原(collagen IV,COL-IV)的蛋白表達,采用transwell方法檢測細胞遷移率。結果:(1)TGF-

6、β1刺激后,HK-2細胞FAK蛋白表達逐漸增多, E-cadherin蛋白表達下調。脂質體轉染FAK-siRNA后可以顯著抑制FAK蛋白的增加并逆轉E-cadherin蛋白的下調表達。(2)TGF-β1可以誘導Akt的活化,即磷酸化的Akt 增多,但這種增加趨勢同樣被FAK-siRNA 所抑制。(3) PI3K/Akt的抑制劑LY294002能減輕TGF-β1導致的E-cadherin蛋白的下調,但不影響FAK的表達。(4)TGF-β1

7、可導致HK-2細胞中MMP-9表達升高,TIMP-1和collagen IV表達下降,轉染FAK-siRNA后能減輕這些改變。(5)敲低FAK的表達能顯著抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞的遷移能力。結論:FAK在TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞轉分化中發(fā)揮非常重要的作用,可通過PI3K/Akt 途徑實現(xiàn)的。
  
   第三部分:目的:觀察黏著斑激酶(FocAlAdhesion Kinase, FAK)在單側輸尿管梗阻

8、(unilaterAlureterAlobstruction,UUO)大鼠腎間質纖維化中的表達,并探討其表達變化的意義。方法:(1)雄性SD大鼠16只隨機分成兩組:假手術組,單側輸尿管梗阻(UUO)組。麻醉后打開腹腔,假手術組只分離左輸尿管不結扎,UUO組雙結扎左側輸尿管,手術后14天將各組大鼠處死。(2)生化指標檢測:兩組大鼠處死前取血測血鉀、鈉、肌酐。(3)左側腎組織行Masson 染色分析判斷腎間質纖維化程度。(4)免疫組化染色和

9、Western blot 觀察腎間質FAK, E-cadherin,α-SMA的表達,并進行圖像分析探討FAK和E-cadherin表達的相關性。結果:(1)兩組血清鈉,鉀無顯著性差異(p>0.05),血肌酐UUO組較假手術組顯著升高(p<0.05)。(2)Masson 染色示:與假手術組相比, UUO組大鼠腎小管明顯擴張,腎間質膠原纖維增加,纖維化程度明顯增加。(3)UUO組大鼠FAK,α-SMA的表達在腎小球和腎間質均顯著升高,而E

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