脂聯(lián)素基因修飾的脂肪組織基質(zhì)血管組分細胞移植治療心肌梗死的實驗研究.pdf

1、目的: 1.構(gòu)建并鑒定含人脂聯(lián)素(Human adiponectin，Human adipose mostabundant gene transcript1，HapM1)基因的重組慢病毒載體； 2.從大鼠脂肪組織中分離、培養(yǎng)具干細胞標志的基質(zhì)血管組分( Stromalvascular fraction，SVF)細胞，HapM1基因修飾SVF細胞；檢測HapM1在SVF細胞中的表達； 3.探討HapM1基因修飾的S

2、VF細胞移植對大鼠心肌梗死的影響，觀察移植細胞的存活、分化情況。 方法: 1.HapM1基因重組慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 (1)根據(jù)Genbank中HapM1基因序列，設(shè)計上下游引物，通過RT-PCR方法擴增目的基因片段，通過TA克隆篩選正確的重組體，進行酶切鑒定和測序。 (2)通過雙酶切和基因重組亞克隆構(gòu)建HapM1重組慢病毒載體質(zhì)粒pNL- HapM1-IRES2-EGFP，經(jīng)抗生素篩選后，進行酶切

3、鑒定和測序。 2.HapM1基因修飾SVF細胞 (1)通過脂質(zhì)體介導慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞包裝慢病毒，收集病毒進行超速離心濃縮。PCR鑒定病毒基因組中目的基因HapM1的插入。 (2)通過膠原酶消化分離和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法在體外提取、傳代培養(yǎng)大鼠脂肪組織中的SVF細胞，并經(jīng)免疫熒光法檢測CD31、CD34表達情況。 (3)將慢病毒感染SVF細胞，通過熒光顯微鏡觀察報告基因增強型綠色熒光蛋白(

4、Enhanced green fluorescent protein，EGFP)的表達，細胞RT-PCR檢測HapM1的mRNA表達，Western blot檢測HapM1蛋白的表達，內(nèi)皮細胞劃痕遷移實驗檢測所表達HapM1蛋白的生物學活性。 3.HapM1基因修飾的SVF細胞移植對心肌梗死的療效觀察 (1)結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立大鼠心肌梗死模型，觀察心電圖變化驗證模型的成功與否，然后心肌局部移植基因修飾的SVF細胞。

5、 (2)移植4周后通過超聲心動圖及血流動力學檢測評定心功能。 (3)心臟切片HE染色觀察各組大鼠心肌的組織學變化。 (4)熒光顯微鏡下觀察移植細胞的存活和分布，通過CTNI抗體的免疫熒光染色觀察移植細胞在心肌中的分化情況，通過HapM1抗體的免疫熒光染色觀察目的蛋白在心肌中的表達情況，通過對Ⅷ因子相關(guān)抗原的免疫熒光檢測測定血管內(nèi)皮密度。 結(jié)果: 1.獲得了長度為735bp的HapM1目的基因片段，

6、HapM1基因重組慢病毒載體質(zhì)粒pNL-HapM1-IRES2-EGFP經(jīng)雙酶切后凝膠電泳鑒定正確，測序結(jié)果與Genbank報道序列完全一致。 2.HapM1基因修飾SVF細胞 (1)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細胞包裝慢病毒后熒光顯微鏡下觀察可見較強綠色熒光，重組慢病毒經(jīng)PCR鑒定有目的基因條帶。 (2)通過膠原酶消化分離和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法獲得了SVF細胞，免疫熒光檢測顯示CD31陰性、CD34陽性。 (

7、3) SVF細胞受慢病毒感染后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光，RT-PCR、Western blot檢測到有HapM1轉(zhuǎn)錄和表達，所表達的HapM1蛋白具有促進內(nèi)皮細胞遷移的生物學活性。 3.HapM1基因修飾的SVF細胞移植對心肌梗死的療效觀察 (1)經(jīng)SVF細胞移植治療的心肌梗死大鼠的心臟功能和組織學的恢復都好于對照組。HapM1基因修飾的SVF細胞移植治療的心肌梗死大鼠心臟功能和組織學恢復狀況明顯優(yōu)于單純SVF細胞治療

8、組。 (2)移植的SVF細胞可存活于心肌缺血損傷部位。EGFP標記的SVF細胞移植后在缺血心肌組織中有局部分布。 (3)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)部分的SVF細胞表達心肌的特異標志物CTNI。 (4)免疫熒光染色顯示，SVF細胞移植后心梗區(qū)心肌組織Ⅷ因子相關(guān)抗原表達明顯增高。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建含目的基因HapM1和報告基因EGFP的重組慢病毒載體pNL-HapMI-IRES2-EGFP，成功包裝含目的基

9、因HapM1的重組慢病毒。 2.成功對SVF細胞進行HapM1基因修飾，功能基因HapM1和報告基因EGFP在SVF細胞上均獲得表達，為HapM1基因修飾的SVF細胞治療研究提供直觀的檢測手段。 3.HapM1基因修飾的SVF細胞有HapM1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，所表達的HapM1蛋白具有促進內(nèi)皮細胞遷移的生物學活性。 4.HapM1基因修飾的SVF細胞可在心肌損傷部位存活，分化表達心肌細胞標志物。 5.H