仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料調(diào)控單核細(xì)胞促骨原位再生的研究.pdf

1、近年來(lái)，用于骨缺損修復(fù)的人工替代材料的研究取得了很大的進(jìn)展，大量新型的修復(fù)材料已在臨床上取得了廣泛的應(yīng)用。然而不同的材料由于其理化性能、機(jī)械性能以及生物應(yīng)用性能方面的不同，修復(fù)效果差異很大。生物材料在植入體內(nèi)后，宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)是影響其最終應(yīng)用效果的最重要的因素之一。在早期的研究中，組織修復(fù)的研究策略傾向于抑制宿主的免疫應(yīng)答來(lái)提高移植的成功率。而目前普遍接受的觀點(diǎn)認(rèn)為，宿主的免疫應(yīng)答能夠?qū)M織再生修復(fù)起到積極的免疫調(diào)控作用，從而促進(jìn)缺

2、損修復(fù)以及組織再生。單核細(xì)胞是宿主免疫應(yīng)答調(diào)控中的重要細(xì)胞，同時(shí)也是骨改建以及骨缺損修復(fù)進(jìn)程中不可或缺的關(guān)鍵細(xì)胞之一，單核細(xì)胞與植入體內(nèi)的生物材料之間的相互作用也是影響生物材料移植成功的關(guān)鍵因素之一。仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架（SCS），以膠原纖維內(nèi)部無(wú)定形水合二氧化硅有序沉積為特征，是一種具有良好理化性能和機(jī)械性能的生物材料。在前期的研究中，這種支架材料，在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的促進(jìn)骨再生修復(fù)的潛力。然而其在體內(nèi)應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)效果尚

3、不明確，同時(shí)宿主免疫系統(tǒng)對(duì)其產(chǎn)生的反應(yīng)目前仍未得到相關(guān)的評(píng)估。在本研究中，我們對(duì)仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用進(jìn)行了全面的生物學(xué)評(píng)估，驗(yàn)證了其在動(dòng)物模型上修復(fù)骨缺損的效果，并對(duì)其與宿主的免疫調(diào)控之間的相互作用進(jìn)行了相關(guān)的探索，驗(yàn)證了該支架材料與單核細(xì)胞之間的作用，以及通過(guò)調(diào)控單核細(xì)胞來(lái)促進(jìn)組織血管化、種子細(xì)胞募集，以及促進(jìn)骨再生的作用。
　　1.研究思路
　　在第一部分實(shí)驗(yàn)中，我們采用膠原纖維模板誘導(dǎo)納米液相

4、礦物質(zhì)前體（無(wú)定形硅酸）纖維內(nèi)定向沉積的技術(shù)，構(gòu)建出了仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架，并使用顯微CT（Micro-CT）技術(shù)和透射電子顯微鏡（TEM）技術(shù)對(duì)所構(gòu)建出的纖維內(nèi)硅化膠原支架進(jìn)行了形貌觀察；隨后對(duì)其在體液環(huán)境中的硅酸的緩釋水平進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)小鼠體內(nèi)異位植入模型對(duì)仿生纖維內(nèi)硅化膠原材料的生物相容性進(jìn)行了全面的評(píng)價(jià)：通過(guò)淋巴細(xì)胞二次刺激增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)硅化膠原的免疫原性；采用流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry）評(píng)價(jià)異位植入的材料對(duì)循

5、環(huán)淋巴細(xì)胞水平以及活性的影響；通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)觀察異位植入的材料對(duì)循環(huán)炎癥因子水平的影響；通過(guò)植入部位組織學(xué)切片的HE染色來(lái)觀察原位炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，為其進(jìn)一步用于骨缺損修復(fù)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　在第二部分實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用纖維內(nèi)硅化膠原支架修復(fù)了小鼠的顱骨缺損，并對(duì)其修復(fù)效果進(jìn)行了評(píng)估。在植入后即刻、1個(gè)月、3個(gè)月時(shí)采用Micro-CT技術(shù)對(duì)骨缺損的修復(fù)情況、新骨形成量以及骨密度進(jìn)行了測(cè)定；采用貫序熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)修復(fù)后3個(gè)月時(shí)

6、的骨改建活性進(jìn)行了評(píng)估；使用修復(fù)后3個(gè)月時(shí)的組織標(biāo)本制作硬組織切片，采用Van Gieson染色（VG staining）和von Kossa銀染（VK sliver staining）技術(shù)對(duì)切片分別進(jìn)行染色，在組織學(xué)水平觀察原位骨再生的情況；在修復(fù)后3個(gè)月時(shí)，采用血管造影技術(shù)對(duì)缺損原位的血管再生水平進(jìn)行評(píng)估；在修復(fù)后1個(gè)月時(shí)進(jìn)行組織學(xué)切片，通過(guò)免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence）、免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunohist

7、ochemistry）對(duì)缺損部位相關(guān)的單核巨噬細(xì)胞，以及骨修復(fù)過(guò)程中的相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估，并采用 TRAP染色（tartrate-resistant acid phosphatase staining）對(duì)骨改建活性進(jìn)行評(píng)估。
　　在第三部分實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)纖維內(nèi)硅化膠原支架材料對(duì)單核細(xì)胞的調(diào)控作用進(jìn)行了深入研究。通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平測(cè)定實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)支架材料對(duì)單核細(xì)胞增殖、凋亡、活性氧

8、水平的影響；采用TRAP細(xì)胞染色技術(shù)來(lái)檢測(cè)支架材料對(duì)單核細(xì)胞分化的影響；通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)、qRT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測(cè)支架材料對(duì)單核細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌水平的影響；通過(guò)Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)支架材料與單核細(xì)胞相互作用后對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和血管內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPCs）遷移的影響；通過(guò)Matrigel血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)EPCs成血管能力的影響；通過(guò)添加中和抗體來(lái)檢驗(yàn)支架材料調(diào)控單核細(xì)

9、胞影響細(xì)胞遷移與血管生成的關(guān)鍵細(xì)胞因子。
　　在第四部分實(shí)驗(yàn)中，我們采用仿生硅化膠原支架材料修復(fù)SD大鼠的股骨缺損，進(jìn)一步對(duì)支架材料通過(guò)影響單核細(xì)胞調(diào)控骨再生的信號(hào)通路進(jìn)行了研究。通過(guò)顯微CT技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)以及Van Geison染色技術(shù)對(duì)支架材料修復(fù)后1個(gè)月時(shí)，缺損部位的成骨水平，以及血管生成水平進(jìn)行了評(píng)估；采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)對(duì)缺損原位的單核細(xì)胞以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估；并進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中，采用Wester

10、n Blot技術(shù)對(duì)單核細(xì)胞相關(guān)的分子信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)；采用Western Blot技術(shù)、TRAP細(xì)胞染色技術(shù)以及Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、Matrigel血管形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路對(duì)單核細(xì)胞分化和分泌的影響；最后通過(guò)體內(nèi)應(yīng)用通路抑制劑，來(lái)觀察相關(guān)信號(hào)通路阻斷后，股骨缺損修復(fù)水平的改變。
　　2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　第一部分、仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架的制備與表征
　　1)透射電鏡觀察下，仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料的纖維

11、內(nèi)部間隙中可見(jiàn)無(wú)定形的二氧化硅有序沉積，從而形成明顯的帶狀結(jié)構(gòu)。Micro-CT結(jié)果可見(jiàn)仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架為具有多孔隙特征的三維網(wǎng)狀纖維支架結(jié)構(gòu)。在模擬體液環(huán)境中，材料能夠穩(wěn)定的緩釋硅酸，在1-10天時(shí)緩釋速度較快，10-30天時(shí)緩釋速度趨于平穩(wěn)，平均每100mg硅化膠原在10mL PBS中暴露30天后，溶液中的硅酸濃度能達(dá)到約1.2mmol/L的水平。
　　2)仿生硅化膠原支架材料的生物相容性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：材料具有較低的免疫

12、原性，對(duì)淋巴細(xì)胞的二次刺激并沒(méi)有引起明顯的增殖反應(yīng)（p＞0.05）；同時(shí)，材料的異位植入對(duì)循環(huán)淋巴細(xì)胞的數(shù)量、活性沒(méi)有影響（p＞0.05），循環(huán)中的炎癥因子濃度也維持在正常水平（p＞0.05）；原位組織學(xué)切片的 HE染色結(jié)果顯示，硅化膠原支架在植入后7天、14天發(fā)生了明顯的吸收，材料周?chē)鸁o(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，證明了仿生硅化膠原支架材料具有良好的生物相容性，可以進(jìn)一步安全地應(yīng)用于體內(nèi)骨缺損修復(fù)。
　　第二部分、仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架修

13、復(fù)小鼠顱骨缺損的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　1)Micro-CT結(jié)果顯示仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料能夠明顯的提升小鼠顱骨缺損的修復(fù)水平（P＜0.05）。和對(duì)照組相比，在術(shù)后三個(gè)月時(shí)，能夠觀察到形成了更多的新骨，同時(shí)其修復(fù)后的骨組織的改建活動(dòng)更加活躍。
　　2)與對(duì)照組相比，在術(shù)后三個(gè)月硅化膠原支架材料修復(fù)后的顱骨缺損區(qū)域形成了更多的血管組織，其血管長(zhǎng)度、厚度、連接性均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。
　　3)在術(shù)后一個(gè)月時(shí)，硅化

14、膠原支架材料修復(fù)的缺損區(qū)域出現(xiàn)了更多的CD31+Endomucin+雙陽(yáng)性的血管，并且有更多的PDGF-BB表達(dá)；缺損區(qū)域內(nèi)TRAP陽(yáng)性的單核細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時(shí)單核細(xì)胞表達(dá)更多的趨化因子SDF-1以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1；在硅化膠原支架材料修復(fù)后，缺損區(qū)域有更多的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)，提示募集到了更多的修復(fù)種子細(xì)胞（p均＜0.05）。
　　第三部分、仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架調(diào)控

15、單核細(xì)胞影響成骨成血管的實(shí)驗(yàn)研究
　　1)硅化膠原支架材料對(duì)單核細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平均沒(méi)有影響（p＞0.05）；材料自身所緩釋的浸提液對(duì)BMSCs和EPCs的遷移也沒(méi)有影響（p＞0.05）。
　　2)硅化膠原支架材料能夠促進(jìn)單核細(xì)胞向 TRAP陽(yáng)性的單核細(xì)胞分化（P＜0.05），該類型的單核細(xì)胞能夠在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平表達(dá)更多的相關(guān)細(xì)胞因子（SDF-1，TGF-β，VEGF，PDGF-BB）（p均＜0.05）。

16、
　　3)使用硅化膠原支架材料對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行刺激后的條件培養(yǎng)基能夠明顯的促進(jìn)BMSCs和EPCs的遷移（P＜0.05），及EPCs的成血管能力（P＜0.05）；中和抗體實(shí)驗(yàn)證明條件培養(yǎng)基中的SDF-1，TGF-β和PDGF-BB是促進(jìn)遷移的關(guān)鍵細(xì)胞因子，而TGF-β，VEGF，PDGF-BB則是促進(jìn)EPCs成血管的關(guān)鍵細(xì)胞因子。
　　第四部分、仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架調(diào)控單核細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究
　　1)硅化膠原支架材

17、料對(duì)不同類型的骨缺損修復(fù)均有良好的應(yīng)用，在大鼠股骨部分缺損的動(dòng)物模型中，材料能夠明顯的促進(jìn)血管與骨的再生（P＜0.05），缺損局部形成了更多的血管結(jié)構(gòu)和更多的小梁骨結(jié)構(gòu)（P＜0.05），表明其具有明顯的促進(jìn)愈合和骨重建的作用；免疫熒光雙標(biāo)的結(jié)果顯示，缺損區(qū)域有更多的CD31+Emcn+雙陽(yáng)性的血管生成（P＜0.05），同時(shí)表達(dá)更多的TRAP+的單核細(xì)胞（P＜0.05），單核細(xì)胞的PDGF-BB分泌也明顯增多（P＜0.05）。
　　

18、2)在體外實(shí)驗(yàn)中，硅化膠原支架材料刺激后，單核細(xì)胞的P38和ERK1/2被激活；使用通路抑制劑分別抑制P38和ERK1/2后，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞向TRAP陽(yáng)性細(xì)胞的分化和相關(guān)細(xì)胞因子（SDF-1，TGF-β，VEGF，PDGF-BB）的分泌水平明顯下降（P＜0.05），其與支架材料共培養(yǎng)后的條件培養(yǎng)基促進(jìn)細(xì)胞遷移和EPCs成血管的能力也明顯下降（P＜0.05）；進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，在P38抑制后，大鼠股骨缺損局部形成的CD31+Emcn

19、+雙陽(yáng)性的血管明顯減少（P＜0.05），TRAP陽(yáng)性單核細(xì)胞的數(shù)目以及單核細(xì)胞表達(dá)PDGF-BB的水平也明顯降低（p均＜0.05），表明硅化膠原支架材料能夠通過(guò)激活 P38信號(hào)通路來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)單核細(xì)胞的分化和分泌能力，從而影響骨缺損修復(fù)的進(jìn)程。
　　3.結(jié)論
　　1)仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料表現(xiàn)出了低免疫原性的特征，能夠使宿主的免疫炎癥反應(yīng)控制在較低的水平范圍內(nèi)，并且不會(huì)引起局部組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及循環(huán)炎癥細(xì)胞和炎癥因子

20、的上升，具有良好的生物相容性，在生物應(yīng)用方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。
　　2)纖維內(nèi)仿生硅化膠原支架能夠應(yīng)用于不同類型的骨缺損修復(fù)（小鼠顱骨缺損，大鼠股骨部分缺損），可以促進(jìn)缺損局部的血管再生和骨重建，具有良好的骨缺損修復(fù)效果。
　　3)在骨缺損的修復(fù)早期，仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料能夠通過(guò)對(duì)單核細(xì)胞P38信號(hào)通路的激活，促進(jìn)單核細(xì)胞向TRAP陽(yáng)性單核細(xì)胞分化，分泌更多的相關(guān)細(xì)胞因子（SDF-1，TGF-β，VEGF，PDGF-BB

21、）；一方面能夠促進(jìn)局部的血管生成，尤其是形成更多的CD31+Emcn+雙陽(yáng)性血管，更好的促進(jìn)成骨成血管的協(xié)同作用（Coupling），另一方面能夠募集更多的宿主種子細(xì)胞（BMSCs，EPCs）到缺損區(qū)域，從而進(jìn)一步促進(jìn)局部的血管生成和骨再生。
　　綜上所述，仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料具有良好的生物相容性，在動(dòng)物骨缺損模型的修復(fù)中表現(xiàn)出了良好的修復(fù)效果，能夠明顯促進(jìn)缺損局部的血管化和骨生成；仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料能夠通過(guò)對(duì)單核細(xì)