芥菜開(kāi)花調(diào)控蛋白AGL24與SOC1基因相互作用的分子機(jī)制.pdf

1、芥菜是我國(guó)南方廣泛栽植的十字花科蔬菜作物，開(kāi)花時(shí)間的早晚將會(huì)影響產(chǎn)品器官的產(chǎn)量與品質(zhì)。雖然在模式植物擬南芥中已分離出大量與開(kāi)花相關(guān)的基因，但是，在蔬菜作物芥菜上這些同源基因是否具有相似的功能，它們調(diào)控芥菜開(kāi)花時(shí)間的分子機(jī)制究竟如何，目前并不清楚。迄今為止，有關(guān)芥菜AGL24蛋白與SOC1基因之間的作用機(jī)制仍未見(jiàn)報(bào)道。
　　為了研究芥菜AGL24蛋白與SOC1基因的互作機(jī)理，本試驗(yàn)通過(guò)酵母單雜交體系和雙螢光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)了芥菜

2、SOC1啟動(dòng)子的全長(zhǎng)、截短體（含CArG-box基序的3個(gè)SOC1小片段）、突變體（CArG-box基序突變后的小片段）分別與AGL24蛋白之間的相互作用，從而篩選SOC1啟動(dòng)子與AGL24蛋白的結(jié)合區(qū)域。此外還利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)AGL24轉(zhuǎn)化芥菜，從體內(nèi)驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株對(duì)SOC1基因表達(dá)及開(kāi)花的影響。為深入研究SOC1基因的表達(dá)調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.芥菜AGL24基因的克隆及生物信息學(xué)分析

3、r>　　以芥菜莖尖總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈作為模板，擴(kuò)增得到的AGL24基因的cDNA序列為666bp，預(yù)測(cè)編碼221個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)ProtParam軟件分析表明AGL24蛋白由20種氨基酸組成，其中Leu和Ser所占比例最高，相對(duì)分子質(zhì)量為24.902kDa，理論等電點(diǎn)為7.67。
　　2.芥菜SOC1啟動(dòng)子全長(zhǎng)與AGL24蛋白相互作用檢測(cè)
　　篩選抑制重組酵母菌Y1H（pAbAi-SOC1）生長(zhǎng)的環(huán)酯肽抗生素（A

4、ureobasidin A，簡(jiǎn)稱AbA）的最低濃度，結(jié)果表明當(dāng)AbA濃度為100ng/mL時(shí)，酵母重組菌株Y1H（pAbAi-SOC1）不能生長(zhǎng)，由此說(shuō)明抑制重組酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1）的AbA最低濃度為100ng/mL。然后將構(gòu)建好的酵母表達(dá)載體pGADT7-AGL24轉(zhuǎn)化到Y(jié)1H（pAbAi-SOC1）酵母感受態(tài)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)二倍體酵母Y1H（SOC1+AGL24）能在SD/-Leu/AbA100上正常生長(zhǎng)，表明芥菜SO

5、C1啟動(dòng)子能與AGL24蛋白相互作用。
　　同時(shí)，構(gòu)建雙螢光素酶表達(dá)載體LUC-SOC1和SK-AGL24，通過(guò)冷熱刺激法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101（pSoup）中。然后將這兩種菌液按1：9的比例混合共侵染6片左右真葉的本氏煙，60h后在GloMax?-Multi+多功能檢測(cè)儀上檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶活性和海腎螢光素酶的活性，并計(jì)算螢火蟲(chóng)螢光素酶與海腎螢光素酶的比值。結(jié)果表明，試驗(yàn)組的比值顯著高于陰性對(duì)照組的，說(shuō)明SOC1啟動(dòng)子與AGL

6、24蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)可以互作。
　　3.芥菜SOC1啟動(dòng)子的截短體與AGL24蛋白相互作用檢測(cè)
　　為了進(jìn)一步找出AGL24蛋白與SOC1啟動(dòng)子結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，本試驗(yàn)篩選出抑制重組酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1-1）、Y1H（pAbAi-SOC1-2）和Y1H（pAbAi-SOC1-3）生長(zhǎng)的AbA最低濃度分別為100ng/mL、150ng/mL和100ng/mL。然后將酵母重組質(zhì)粒pGADT7-AGL24分別轉(zhuǎn)化到Y(jié)

7、1H（pAbAi-SOC1-1）、Y1H（pAbAi-SOC1-2）和Y1H（pAbAi-SOC1-3）酵母感受態(tài)細(xì)胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只有二倍體酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1-2+AGL24）能在含有相應(yīng)AbA背景濃度下的培養(yǎng)基SD/-Leu/AbA150上正常生長(zhǎng)，而其他的均不能生長(zhǎng)。
　　為了進(jìn)一步鑒定芥菜SOC1啟動(dòng)子截短體與AGL24在植物體內(nèi)的互作情況，本試驗(yàn)分別將SOC1啟動(dòng)子的三個(gè)截短體與雙螢光素酶表達(dá)載體pGr

8、een II0800-LUC連接，得到重組質(zhì)粒LUC-SOC1-1、LUC-SOC1-2和LUC-SOC1-3，通過(guò)冷熱刺激法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101（pSoup）。然后分別將轉(zhuǎn)有啟動(dòng)子片段的農(nóng)桿菌菌液和轉(zhuǎn)有AGL24蛋白的農(nóng)桿菌菌液按OD600比值1：9混合均勻。再將混勻的菌液分別侵染6片真葉的本氏煙，60h后在GloMax?-Multi+多功能檢測(cè)儀上檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶活性和海腎螢光素酶的活性，并計(jì)算螢火蟲(chóng)螢光素酶與海腎螢光

9、素酶的比值。結(jié)果表明：所有試驗(yàn)組的比值均顯著高于陰性對(duì)照組的比值。說(shuō)明三個(gè)截短體SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3均能與AGL24蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)相互作用。
　　4.芥菜SOC1的啟動(dòng)子CArG-box突變體與AGL24相互作用檢測(cè)
　　為了更進(jìn)一步分析AGL24蛋白是否特異性的結(jié)合到SOC1啟動(dòng)子截短體上的CArG-box基序，本試驗(yàn)提取實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的兩種SOC1啟動(dòng)子突變體片段（CArG-box內(nèi)A-T堿基互換突

10、變及CArG-box刪除突變體）與酵母表達(dá)載體連接的重組質(zhì)粒，然后將其分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)菌株Y1H。篩選出抑制酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1-1E）、Y1H（pAbAi-SOC1-2E）和Y1H（pAbAi-SOC1-3E）生長(zhǎng)的AbA最低濃度分別為100ng/mL、150ng/mL和200ng/mL，抑制酵母菌株Y1H（pAbAi-SOC1-1D）、Y1H（pAbAi-SOC1-2D）和Y1H（pAbAi-SOC1-3D）生長(zhǎng)的

11、AbA最低濃度分別均為100ng/mL。然后將酵母重組質(zhì)粒pGADT7-AGL24分別轉(zhuǎn)化到Y(jié)1H（pAbAi-SOC1-1E）、Y1H（pAbAi-SOC1-2E）、Y1H（pAbAi-SOC1-3E）、Y1H（pAbAi-SOC1-1D）、Y1H（pAbAi-SOC1-2D）、Y1H（pAbAi-SOC1-3D）酵母感受態(tài)細(xì)胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所有二倍體酵母菌株均不能在含有相應(yīng)AbA背景濃度下的培養(yǎng)基SD/-Leu/AbA上正常生長(zhǎng)。<

12、br>　　為了進(jìn)一步確定芥菜SOC1啟動(dòng)子突變體片段與AGL24在植物體內(nèi)的互作情況，本試驗(yàn)分別將SOC1啟動(dòng)子的6個(gè)突變體片段與雙螢光素酶表達(dá)載體pGreen II0800-LUC連接，得到重組質(zhì)粒LUC-SOC1-1E、LUC-SOC1-2E、LUC-SOC1-3E、LUC-SOC1-1D、LUC-SOC1-2D、LUC-SOC1-3D。并將重組質(zhì)粒通過(guò)冷熱刺激法分別轉(zhuǎn)化重組農(nóng)桿菌GV3101（pSoup），按OD600的比值1：9

13、將啟動(dòng)子突變體片段與AGL24蛋白混合均勻。然后將混勻的菌液分別侵染6片真葉的本氏煙，60h后在GloMax?-Multi+多功能檢測(cè)儀上檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶活性和海腎螢光素酶的活性，并計(jì)算螢火蟲(chóng)螢光素酶與海腎螢光素酶的比值。結(jié)果表明：所有試驗(yàn)組的比值與陰性對(duì)照組的比值差異不顯著。說(shuō)明SOC1截短體小片段CArG-box內(nèi)A堿基與T堿基互換或者刪除CArG-box后，均不能與AGL24蛋白發(fā)生相互作用。以此推斷：SOC1與AGL24之間的