散結消癭方及溫腎健脾方對自身免疫性甲狀腺炎大鼠免疫學機制的研究.pdf

1、目的: 本課題通過觀察散結消癭方及溫腎健脾方對自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型進行干預、治療，深入探討散結消癭方及溫腎健脾方對自身免疫性甲狀腺炎的治療作用，從細胞凋亡及免疫應答、細胞炎性因子方面進一步明確其發(fā)病機制，并從中醫(yī)“痰瘀”及“脾腎虧虛”的角度來探討自身免疫性甲狀腺炎的中醫(yī)病機，進一步加深對自身免疫性甲狀腺炎免疫學發(fā)病機理及中醫(yī)病機的認識，為其治療提供新的思路。 方法: 將健康的雌性Wistar大鼠90只，體重

2、約120±20g，購回后適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為6組：正常組(G1)：15只；模型組(G2)：15只；雷公藤組(G3)：15只；散結消癭方組(G4)：15只；溫腎健脾方組(G5)：15只；散結消癭方及溫腎健脾方聯合治療組(G6)：15只。G1組給予普通飼料飼養(yǎng)；G2-G6組造模：將甲狀腺球蛋白100mg完全溶解于雙蒸水50ml中，取10ml與等體積完全弗化劑充分混合成油包水狀，取0.5ml在背、腹腔、腿、頸全身等多點皮下注射作為初次免疫

3、，第2周取甲狀腺球蛋白10ml與不完全弗化劑10ml充分混合后作為加強免疫，以后每周一次，至第5周，期間配合高碘水(1L水中加入0.64g碘化鈉配制)飲水喂養(yǎng)；第6周開始，G2組給予普通飼料及飲水飼養(yǎng)至9周；G3組給予雷公藤片1.08mg/kg.d灌胃至10周；G4組給予散結消癭湯20g/kg.d灌胃至10周；G5組給予溫腎健脾方組20g/kg.d灌胃至10周；G6組給予散結消癭湯及溫腎健脾聯合方20g/kg.d灌胃至10周。

4、第11周將大鼠處死，取血并取出甲狀腺組織，做HE染色光鏡下觀察；TGAb、TpoAb、FT3、FT4、TSH按照試劑盒要求檢測；肝功能、腎功能、血液分析做生化及計數分析；TNF—α、IL-6用ELISA法檢測；甲狀腺上皮細胞CD40、Fas、FasL表達用免疫組化法檢測； 結果: 1．模型組血清TGAb和TPOAb較正常組升高，具有顯著性差異(P＜0.01)。雷公藤治療組TGAb和TPOAb較模型組降低，有顯著性差異(P

5、＜0.05)；散結消癭方組及聯合方治療組TGAb和TPOAb較模型組降低，有顯著性差異(P＜0.01)；散結消癭方組及聯合方治療組TGAb和TPOAb較雷公藤治療組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；溫腎健脾方組TGAb和TPOAb較模型組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；散結消癭方及聯合方治療組組間TGAb和TPOAb比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 光鏡結構：正常組見完整濾泡上皮細胞，背景膠質豐富，呈濃稠片7狀分布，濾泡間血

6、管豐富，未見巨噬細胞和淋巴細胞，上皮細胞未見嗜酸性變。模型組甲狀腺組織間質內可見廣泛的淋巴細胞浸潤，甲狀腺上皮細胞呈明顯的嗜酸性改變，并見淋巴組織分布于小葉內及小葉周邊，形成具有生發(fā)中心的淋巴濾泡。雷公藤組、散結消癭方組、溫腎健脾方組及聯合方治療組甲狀腺組織間質內淋巴浸潤較模型組明顯減少，小葉內及小葉周邊形成具有生發(fā)中心的淋巴濾泡較模型組也明顯減少。淋巴細胞主要浸潤范圍及程度較模型組也有所減少，散結消癭方組及聯合方治療組淋巴細胞浸潤程度

7、較雷公藤組及溫腎健脾方組明顯減少，范圍也明顯變小，濾泡上皮細胞嗜酸性變較雷公藤組及溫腎健脾方組變淺，未見明顯淋巴細胞形成的生發(fā)中心。 2．模型組淋巴細胞浸潤程度較正常組明顯增多，具有顯著性差異(P＜0.05)。雷公藤治療組、溫腎健脾方組淋巴細胞浸潤程度較模型組顯著降低，范圍明顯縮小，有顯著性差異(P＜0.05)；散結消癭方組及聯合方治療組淋巴細胞浸潤程度較模型組顯著降低，范圍明顯縮小，有顯著性差異(P＜0.01)；散結消癭方組、

8、聯合方治療組較雷公藤治療組淋巴細胞浸潤程度有所減少，有顯著性差異(P＜0.05)。溫腎健脾方組治療組淋巴細胞浸潤程度較雷公藤治療組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 3．甲狀腺功能：TSH含量正常組、模型組、雷公藤治療組、散結消癭方組、溫腎健脾方組及聯合方治療組間無顯著性差異(P＞0.05)；FT3、FT4含量正常組、模型組、雷公藤治療組、散結消癭方組間無差異(P＞0.05)；溫腎健脾方組及聯合方治療組FT3、FT4較模型組有顯

9、著性差異(P＜0.05)。 4．造模前兩周模型組與正常組體重、進食量及排泄量無明顯差異，從第三周起，模型組大鼠體重增加較正常組明顯減緩，進食量相對減少，活動減少，精神欠佳，大便干結，體重、進食量及排泄量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 用藥干預后可見溫腎健脾方組較模型組、雷公藤治療組、散結消癭方組及聯合方治療組大鼠體重增幅明顯增大，飲食量、大便量明顯增多，活動較其他組頻繁。可以看到雷公藤治療組大鼠食欲減退、活

10、動量少考慮與其胃腸系統(tǒng)副作用有關。 模型組體溫較正常組明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.01)。雷公藤治療組、散結消癭方組體溫較模型組明無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；溫腎健脾方組、聯合方治療組較其他組體溫有所上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時我們可以明顯觀察到溫腎健脾方組、散結消癭方組及聯合方治療組大鼠活動及精神狀態(tài)明顯好于模型組。 5．模型組與正常組肝功能、血白細胞、紅細胞、血紅蛋白及血小板、肌酐、尿素氮無統(tǒng)

11、計學差異(P＞0.05)；雷公藤治療組AST、腎功能、血自細胞、紅細胞較正常組有顯著性差異(P＜0.05)；散結消癭方組、溫腎健脾方組及聯合方治療組AST、腎功能、血白細胞、紅細胞較雷公藤治療組有顯著性差異(P＜0.05)；散結消癭方組、溫腎健脾方組及聯合方治療組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 6．正常組甲狀腺組織Fas和FasL免疫陽性物呈淺棕色，在甲狀腺上皮細胞表達很少，范圍很小，顏色較淺；模型組甲狀腺上皮細胞表達Fas和

12、FasL免疫陽性物呈深棕色，表達范圍廣，顏色深，其OD值與正常組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。散節(jié)消癭方組、聯合方治療組較雷公藤治療組甲狀腺上皮細胞表達Fas和FasL顏色顯著變淺，OD值有顯著性差異(P＜0.05)。溫腎健脾方組較雷公藤治療組OD值無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；散結消癭方組、聯合方治療組間甲狀腺上皮細胞表達Fas和FasL差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 7．正常組甲狀腺上皮細胞表達CD40免疫陽性物呈淺

13、棕紅色，表達范圍很??；模型組甲狀腺上皮細胞表達CD40免疫陽性物呈棕紅色，表達范圍廣，顏色深，其OD值與正常組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)；散節(jié)消癭方組、聯合方治療組甲狀腺上皮細胞表達CD40較雷公藤治療組顏色明顯變淺，OD值有顯著性差異(P＜0.05)。溫腎健脾方組較雷公藤治療組甲狀腺上皮細胞表達CD40無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。散結消癭方組、聯合方治療組間甲狀腺上皮細胞表達CD40差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

14、8．模型組血清TNF—α含量較正常組升高，具有顯著性差異(P＜0.01)。雷公藤治療組、散結消癭方組、聯合方治療組及溫腎健脾方組血清TNF—α較模型組降低，有顯著性差異(P＜0.01)；散結消癭方組及聯合方治療組血清TNF—α含量較雷公藤治療組及溫腎健脾方組降低，具有顯著性差異(P＜0.01)；散結消癭方組、聯合方治療組間血清TNF—α，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 9．模型組血清IL-6含量較正常組升高，具有顯著性差異(

15、P＜0.01)。雷公藤治療組、散結消癭方組、聯合方治療組及溫腎健脾方組血清IL-6較模型組降低，有顯著性差異(P＜0.01)；散結消癭方組及聯合方治療組血清IL-6含量較雷公藤治療組及溫腎健脾方組降低，具有顯著性差異(P＜0.01)；散結消癭方組、聯合方治療組間血清IL-6，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 結論: 1．散結消癭方可以減少自身免疫性甲狀腺炎自身抗體TGAb和TPOAb的形成，減少自身抗體對甲狀腺組織的損

16、傷。 2．散結消癭方及溫腎健脾方都能減少自身免疫性甲狀腺炎淋巴細胞的浸潤，減輕其炎性反應，可以縮小腫大的甲狀腺，但散結消癭方療效尤其顯著，優(yōu)于雷公藤及溫腎健脾方。 3．溫腎健脾方可以增加大鼠食欲，進食量及排泄量增大，升高大鼠基礎體溫，增強甲狀腺功能，并使自身免疫性甲狀腺炎大鼠基礎代謝增加，溫腎健脾方與雷公藤相比較，可避免其胃腸反應，有效改善橋本氏甲狀腺炎的臨床癥狀。對改善自身免疫性甲狀腺炎表現出的甲狀腺功能減退癥狀及調節(jié)

17、甲狀腺功能效果明顯。治療效果優(yōu)于雷公藤片及散結消癭方。 4．散結消癭方、溫腎健脾方對大鼠肝、腎功能及血液系統(tǒng)有保護作用，優(yōu)于雷公藤。 5．散結消癭方、溫腎健脾方都能抑制TNF—α、IL-6過度分泌，減輕炎性因子對甲狀腺的損傷，但散結消癭方效果更為明顯，優(yōu)于雷公藤片及溫腎健脾方。 6．作為第二活化信號的共刺激分子CD40在自身免疫性甲狀腺炎中有異常表達，說明CD40與自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病有關，可以通過Th2途徑