香豆雌酚對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎發(fā)生、發(fā)展的影響研究.pdf

1、背景：
　　自身免疫甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是最常見的自身免疫性甲狀腺病，近年來發(fā)病率明顯增加。AIT患者體內(nèi)存在高滴度抗甲狀腺過氧化物酶(TPO)和甲狀腺球蛋白(Tg)抗體，甲狀腺內(nèi)有明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可導(dǎo)致甲狀腺功能減退。既往研究認(rèn)為AIT可能是由于甲狀腺特異輔助性T細(xì)胞1(Helper T cell1，Th1)持續(xù)活化、增殖所致。然而AIT的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明。AIT的臨床特點(diǎn)

2、及一些初步研究提示雌激素在AIT發(fā)病有重要影響:女性發(fā)病率為男性的3～4倍;該病常在妊娠時(shí)自發(fā)緩解而于分娩后惡化，且青春期發(fā)育是促進(jìn)具有遺傳背景的女性發(fā)病的重要因素。因雌激素對(duì)免疫系統(tǒng)有多方面作用，外源性雌激素能夠通過影響體內(nèi)下丘腦-垂體-性腺軸，從而影響自身免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展。香豆雌酚是從四葉草、苜蓿類及其它可供食用的豆科植物中提取的一種植物雌激素，能夠和體內(nèi)雌激素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ER，尤其是ER-β，通過作用于雌激素反應(yīng)結(jié)合元件，調(diào)節(jié)相

3、關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗雌激素和免疫調(diào)節(jié)等作用。有關(guān)香豆雌酚對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡動(dòng)物模型等多種自身免疫系統(tǒng)疾病的研究已有報(bào)道，但對(duì)AIT發(fā)病有何影響仍不清楚。
　　目的：
　　以Tg免疫易感株小鼠建立的EAT模型為研究對(duì)象，給予小鼠喂養(yǎng)含不同劑量香豆雌酚的飲用水，直接探討香豆雌酚對(duì)EAT發(fā)病的影響，并主要從Th極化與應(yīng)答角度，探討了香豆雌酚的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。
　　方法：
　　4周齡CBA/J雌性小鼠在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4、中心無特定病原體(Speceficpathogen Free，SPF)級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。6周齡時(shí)按美國(guó)Harlan Teklad公司提供的配方(Rodent Diet2016)生產(chǎn)的不含植物雌激素的飼料喂養(yǎng)，并給予含不同劑量香豆雌酚的飲用水，隨機(jī)分為3組。分組如下:
　　對(duì)照組:僅含1％吐溫80的飲用水。
　　L組:0.8mg/L香豆雌酚+1％吐溫80的飲用水。
　　H組:8mg/L香豆雌酚+1％吐溫80的飲用水。

5、　　于9周齡時(shí)給予mTg（200μg/只）加完全弗氏佐劑進(jìn)行初次免疫，11周齡時(shí)重復(fù)免疫一次（mTg加不完全弗氏佐劑），15周齡時(shí)處死動(dòng)物。
　　取甲狀腺組織做石蠟切片HE染色觀察淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況并進(jìn)行甲狀腺炎癥程度評(píng)分;取子宮組織做石蠟切片HE染色觀察子宮黏膜情況;留取血清利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定Tg抗體(TgAb)滴度，包括Tg特異性各IgG亞類;利用雌激素試劑盒測(cè)定血清中雌激素水平;提取小鼠脾細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)

6、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(Quantitative Real-Time Reverse Transcripte Polymerase Chain Reaction,real-time RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞因子:γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ，Th1型細(xì)胞因子）、白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4，IL-4，Th2型因子）、白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17，Th17型因子)、白細(xì)胞介素-

7、21(Interleukin-21，IL-21，Th17型因子)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β，抑制性細(xì)胞因子）以及Th1、Th2、Th17及Tregs特異性轉(zhuǎn)錄因子:叉頭蛋白P3(forkhead boxP3，F(xiàn)oxp3)、T-盒21轉(zhuǎn)錄因子(T-box21 transcription factor，T-bet)、GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein3，G

8、ATA3)、視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γ t(Retinoicacid receptor-related orphan receptorγ t，RORγ t)的信使核糖核酸(Messengerribouncleic acid，mRNA)的表達(dá)水平;取脾制成單個(gè)核細(xì)胞懸液，免疫熒光染色、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)Th1、Th2及B細(xì)胞比例的變化。應(yīng)用SPSS16.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：
　　1、給予香豆雌酚喂養(yǎng)組EAT發(fā)病率、甲狀

9、腺炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，與對(duì)照組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、L組血清Tg特異性抗體IgG1、IgG2a及IgG3滴度較對(duì)照組顯著降低，且IgG2a/IgG1的比值也明顯降低，IgG2b也有降低趨勢(shì);H組血清Tg特異性IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3滴度均有降低趨勢(shì)。
　　3、除L組小鼠脾細(xì)胞中IFN-γ mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組外，余各轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯變化。
　　4、

10、與對(duì)照組相比，L組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Th1（CD4+IFN-γ+細(xì)胞）比例明顯降低，Th2（CD4+IL-4+細(xì)胞）比例有升高趨勢(shì)，且Th1/Th2的比值也明顯下降;H組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞比例與對(duì)照組相比有降低趨勢(shì)，Th2細(xì)胞比例有升高趨勢(shì)，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別;L組、H組小鼠脾臟中B細(xì)胞比例有升高趨勢(shì)，與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5、與對(duì)照組比較，L組小鼠子宮相對(duì)重量明顯降低且子宮內(nèi)膜萎縮較嚴(yán)重，H組小鼠相