雌激素受體α和β活化對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎發(fā)生、發(fā)展的影響研究.pdf

1、背景
　　 自身免疫甲狀腺炎(auto immune thyroiditis,AIT)是最常見(jiàn)的自身免疫性甲狀腺病,近年來(lái)發(fā)病率明顯增加。AIT患者體內(nèi)存在高滴度抗甲狀腺過(guò)氧化物酶(TP0)和甲狀腺球蛋白(Tg)抗體,甲狀腺內(nèi)有明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),可導(dǎo)致甲狀腺功能減退。既往研究認(rèn)為AIT可能是由于中樞免疫耐受被破壞、天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T lynmphocytes,Treg)發(fā)育和功能缺陷及樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)

2、和甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞(thyroid epithelial cells,TECs)異常的抗原遞呈作用,導(dǎo)致甲狀腺特異輔助性T細(xì)胞1(Helper T cell1,Th1)持續(xù)活化、增殖所致。目前認(rèn)為AIT可能并非僅由經(jīng)典Th1/Th2免疫反應(yīng)所致,有其他免疫反應(yīng)[如分泌白細(xì)胞介素17的輔助性T細(xì)胞(Interleukin-17secreting helper T cells,Th17)]存在。然而AIT的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,尚未完全闡明。AI

3、T的臨床特點(diǎn)及一些初步研究提示雌激素在AIT發(fā)病有重要影響:女性發(fā)病率為男性的3-4倍,高發(fā)年齡在30-50歲;該病常在妊娠時(shí)自發(fā)緩解而于分娩后惡化,且青春期發(fā)育是促進(jìn)具有遺傳背景的女性發(fā)病的重要因素。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)雌激素受體(estrogen receptor,ER)有ERα和ERβ2種亞型,其各自介導(dǎo)的對(duì)靶器官的影響目前在國(guó)際上倍受關(guān)注,已發(fā)現(xiàn)有些情況下二者活化后產(chǎn)生的效應(yīng)類(lèi)似“陰陽(yáng)”平衡。目前最常用的ERα選擇性激動(dòng)劑是化合物prop

4、yl-pyrazole-triol(PPT),β亞型選擇性激動(dòng)劑為diarylpropionitrile(DPN)。亞型選擇性ER激動(dòng)劑現(xiàn)為國(guó)外多家藥物研究機(jī)構(gòu)研發(fā)重點(diǎn),可能給雌激素敏感性疾病提供新的防治手段。關(guān)于雌激素對(duì)AIT發(fā)病有何影響仍不清楚,缺乏直接干預(yù)一效應(yīng)研究,而二種ER亞型各自被激活后所介導(dǎo)的對(duì)該病的作用更是未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的
　　 以Tg免疫易感株小鼠建立的EAT模型為研究對(duì)象,利用亞型選擇性ER激動(dòng)

5、劑,直接探討ERα和ERβ被各自單獨(dú)活化對(duì)AIT發(fā)病的影響,并主要從免疫耐受、抗原遞呈和Th極化與應(yīng)答角度,探討了ER活化介導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。
　　 方法
　　 4周齡CBA/J雌性小鼠在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無(wú)特定病原體(Specefic pathogen Free,SPF)級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。6周齡時(shí)進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除(OVX),之后按美國(guó)Harlan Teklad公司提供的配方(Rodent Diet2016)生產(chǎn)的不含

6、植物雌激素的飼料喂養(yǎng),隨機(jī)分為5組。分組如下:
　　 OVX對(duì)照組:OVX+DMSO/玉米油,皮下注射,每4天1次直至動(dòng)物被處死。
　　 PPT1組:OVX+PPT(2.0mg/kg體重)皮下注射同上。
　　 PPT2組:OVX+PPT(20.0mg/kg體重)皮下注射同上。
　　 DPN1組:OVX+DPN(1.2mg/kg體重)皮下注射同上。
　　 DPN2組:OVX+DPN(12.0mg/k

7、g體重)皮下注射同上。
　　 于9周齡時(shí)給予mTg(200μg/只)加完全弗氏佐劑進(jìn)行初次免疫,11周齡時(shí)重復(fù)免疫一次(mTg加不完全弗氏佐劑),15周齡時(shí)處死動(dòng)物。
　　 取甲狀腺組織做石蠟切片HE染色觀察淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況并進(jìn)行甲狀腺炎癥程度評(píng)分;留取血清利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定Tg抗體(TgAb)滴度,包括Tg特異性總IgG和各IgG亞類(lèi);化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)小鼠總甲狀腺素(Total thyroxine,T

8、T4)及促甲狀腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH);取脾制成單個(gè)核細(xì)胞懸液,免疫熒光染色、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)Tregs、Th17及DCs抗原遞呈細(xì)胞比例的變化;提取小鼠脾細(xì)胞總RNA,實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(Quantitative Real-Time Reverse Transcripte Polymerase Chain Reaction,real-timeRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞因子:γ干擾素(

9、Interferon-γ,IFN-γ,Th1型細(xì)胞因子)、白細(xì)胞介素-4(Interleukin-17,IL-4,Th2型因子)、白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17,Th17型因子)、白細(xì)胞介素-21(Interleukin-21,IL-21,Th17型因子)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β,抑制性細(xì)胞因子)以及Th1、Th2、Th17及Tregs特異性轉(zhuǎn)錄因子:

10、叉頭蛋白P3(forkheadboxP3,Foxp3)、T-盒21轉(zhuǎn)錄因子(T-box21transcriptionfactor,T-bet)、GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein3,GATA3)、視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γt(Retinoic acid receptor-related orphan receptorγt,RORγt)的信使核糖核酸(Messenger ribouncleic acid,mRNA)

11、的表達(dá)水平。應(yīng)用SPSS16.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果
　　 1、給予ERβ選擇性激動(dòng)劑DPN可導(dǎo)致EAT發(fā)病率、甲狀腺炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度加重。而給予ERα選擇性激動(dòng)劑PPT后EAT發(fā)病率、甲狀腺炎癥評(píng)分與OVX對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　 2、給予ERβ選擇性激動(dòng)劑注射的DPN1組血清Tg特異性IgG1、IgG2b滴度較OVX對(duì)照組有升高趨勢(shì),DPN2組血清Tg特異性IgG1、IgG2a、IgG2b滴度顯著

12、升高,IgG3也有升高趨勢(shì)。給予ERQ選擇性激動(dòng)劑注射的PPT組血清TgAb(IgG各亞類(lèi))滴度與OVX對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。
　　 3、與OVX對(duì)照組比較,PPT組的血清TSH無(wú)明顯改變,DPN組的血清TSH有升高的趨勢(shì)(DPN1:P=0.095,DPN2:P=0.092)。血清TT4各組間無(wú)明顯變化。
　　 4、與OVX對(duì)照組相比,DPN1組小鼠脾細(xì)胞DC(CD11c+細(xì)胞)表面表達(dá)協(xié)同刺激因子CD86者(CD11c

13、+CD86+)明顯升高,DPN2組表達(dá)CD80(CD11c+CD80+)、CD86(CD11c+CD86+)者明顯升高。PPT1組和PPT2組小鼠脾細(xì)胞DC中CD80、CD86表達(dá)比例無(wú)顯著變化。DC中產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6、IL-12者均無(wú)明顯差異。
　　 5、除DPN2組小鼠脾細(xì)胞中T-betmRNA表達(dá)量高于OVX對(duì)照組外,各組IFN-γ、IL-4、GATA3mRNA表達(dá)量與OVX對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。
　　 6、D

14、PN組的小鼠脾細(xì)胞中RORγt、IL-17A、IL-21mRNA表達(dá)量增多,Th17細(xì)胞比例升高,以DPN2組最為顯著。PPT2組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Treg(CD4+CD25+FOXP3+細(xì)胞)比例及Foxp3、TGF-βmRNA表達(dá)水平明顯增多,DPN組未見(jiàn)減少,但各組Treg表面功能抑制分子GITR的表達(dá)水平均有上升,以PPT2組和DPN2組最為明顯。
　　 結(jié)論
　　 1、ERβ可能是介導(dǎo)雌激素影響EAT發(fā)生