小鼠GITR的表達(dá)及其對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎干預(yù)的研究.pdf

1、目的:
　　為了探討糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-relatedprotein，GITR)在免疫相關(guān)性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，尋找可能的免疫干預(yù)途徑。本文克隆了小鼠GITR(mGITR)全長;構(gòu)建了帶有小鼠IgGFc(mIgGFc)的mGITR胞外段（mGITR胞外段-mIgGFc）及單獨(dú)mGITR胞外段的兩種原核

2、表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行相關(guān)融合蛋白(mGITR及mGITR-Fc)的表達(dá)和純化;檢測了兩種融合蛋白的體外生物學(xué)活性;觀察mGITR-Fc融合蛋白對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的影響并分析其可能機(jī)制。旨在為GITR的應(yīng)用研究奠定理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)通過RT-PCR法從小鼠脾臟細(xì)胞中擴(kuò)增獲得mGITR基因全長，克隆至pMD18-T載體后，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α宿主菌，挑取菌落驗(yàn)證并取陽性菌落進(jìn)行測序分析。利

3、用網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)和生物信息學(xué)軟件，對(duì)mGITR蛋白氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　(2)應(yīng)用PCR法擴(kuò)增出帶有合適酶切位點(diǎn)的mGITR胞外段基因和mIgGFc段基因，將其分別克隆至pMD18-T載體后進(jìn)行測序分析;再經(jīng)酶切和連接，分別將mGITR胞外段基因單獨(dú)或與mIgGFc段基因聯(lián)合轉(zhuǎn)移至pET32a(+)原核表達(dá)載體。
　　(3)將帶有目的基因的兩種原核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta宿主菌，獲得兩種帶有His

4、的原核蛋白，并分別用鎳柱進(jìn)行純化，然后經(jīng)Western Blot鑒定。
　　(4)采用MACS磁珠分選技術(shù)，分離純化小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，將CD4+T細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，在每孔中加入相同濃度的mGITRL和不同濃度的mGITR或mGITR-Fc融合蛋白，3H-TdR摻入法檢測mGITR胞外段或mGITR胞外段-Fc融合蛋白對(duì)mGITRL刺激CD4+T細(xì)胞增殖的影響。應(yīng)用mGITR-Fc融合蛋白作用樹突狀細(xì)胞，觀察該

5、蛋白對(duì)樹突狀細(xì)胞表面GITRL分子表達(dá)的影響。
　　(5)構(gòu)建小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎模型。利用mGITR-Fc融合蛋白干預(yù)該模型后，通過HE染色、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測其干預(yù)效果。
　　結(jié)果:
　　(1)成功獲得載有小鼠GITR全長基因的重組載體并經(jīng)測序正確，命名為pMD18-T-mGITR。生物信息學(xué)分析顯示小鼠GITR蛋白胞外區(qū)具有較高的可及性，柔韌性及親水性等，GITR蛋白胞外區(qū)的這些特性為進(jìn)一步表達(dá)該蛋白，

6、以及研究其功能奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)成功獲得攜帶mGITR胞外段或mGITR胞外段-mIgGFc基因片段的表達(dá)載體，經(jīng)測序驗(yàn)證，分別命名為pET32a-mGITR胞外段和pET32a-mGITR胞外段-mIgGFc。
　　(3)經(jīng)原核表達(dá)并進(jìn)行蛋白純化，獲得帶有His標(biāo)簽的mGITR胞外段和mGITR胞外段-Fc重組蛋白，并經(jīng)SDS及Westem Blot鑒定。
　　(4)可溶性mGITR和mGITR-Fc融合蛋白，

7、能夠通過與mGITRL的結(jié)合，阻斷其作用于CD4+T細(xì)胞表面的GITR，從而抑制mGITRL刺激的CD4+T細(xì)胞增殖，其抑制作用呈濃度依賴性。此外，體外實(shí)驗(yàn)還表明，應(yīng)用mGITR-Fc融合蛋白體外作用樹突狀細(xì)胞，可見樹突狀細(xì)胞表面GITRL分子表達(dá)下調(diào)。
　　(5)成功建立了小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎模型。應(yīng)用這一動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)表明，本研究制備的mGITR-Fc融合蛋白能夠延緩實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的進(jìn)一步發(fā)展，表現(xiàn)為蛋白干預(yù)

8、后可見病變組織中炎性細(xì)胞浸潤減少、血清中mTgAb水平明顯下降等。
　　結(jié)論:
　　成功克隆了小鼠GITR全長及其胞外段基因;構(gòu)建了pET32a-mGITR胞外段、pET32a-mGITR胞外段-mIgGFc兩種表達(dá)載體;經(jīng)原核表達(dá)成功獲得mGITR和mGITR-Fc融合蛋白。原核表達(dá)的mGITR和mGITR-Fc融合蛋白能夠阻斷mGITRL刺激CD4+T細(xì)胞而使其增殖降低，該作用與GITR/GITRL共刺激信號(hào)相關(guān);mGI