鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白功能影響的體內外結合研究.pdf

1、一、目的： 通過考察鹽酸度洛西汀對Caco-2細胞上P-糖蛋白功能和表達的影響以及對P-糖蛋白底物他林洛爾人體藥動學的影響，探討鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白的作用。 二、方法： （一）鹽酸度洛西汀對Caco-2細胞上P-糖蛋白功能和表達的影響 1.細胞培養(yǎng)以及形態(tài)學驗證 用MEM培養(yǎng)基對Caco-2細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，建立Caco-2細胞模型，流式細胞術進行P-糖蛋白表達驗證。 2.細胞毒性試驗

2、 用MTT法考察鹽酸度洛西汀對Caco-2細胞的毒性，選擇細胞存活率大于90％的藥物濃度作為最大無毒濃度進行下一步細胞試驗。 3.羅丹明-123外排試驗 用維拉帕米作為P-糖蛋白功能抑制的陽性對照，用流式細胞儀測定細胞內羅丹明-123的熒光強度，考察度洛西汀對P-糖蛋白介導的羅丹明-123外排作用的影響，從而判斷藥物對P-糖蛋白功能的影響。 4.P-糖蛋白表達的測定 藥物與細胞作用72h后采用流式

3、細胞術分析度洛西汀對Caco-2細胞上P-糖蛋白表達的影響。 （二）鹽酸度洛西汀對他林洛爾人體藥動學的影響 1.給藥方法 采用隨機開放，兩周期自身前后對照試驗設計，12名健康受試者第一周期單劑量口服他林洛爾1片（50mg），第二周期受試者服用度洛西汀（30mg/次，Bid），連續(xù)服用6天，于第七天晨加服他林洛爾1片（50mg）。洗脫期：1周。 2.血樣采集方法 在他林洛爾服藥前及服藥后0.5，1.

4、1.5，2，3，4，5，6，7，9，12，24，36，48和60h由肘靜脈取血5mL置肝素化離心管中，分離出血漿，置-70℃冰箱中保存待測。 3.測定方法 采用HPLC-ESI-MS/MS法測定血漿中他林洛爾的濃度。 三、結果： （一）鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白作用的研究結果 1.細胞培養(yǎng)以及形態(tài)學驗證 Caco-2形態(tài)正常；流式細胞儀測定顯示Caco-2細胞高度表達P-糖蛋白，適合用于鹽

5、酸度洛西汀對P-糖蛋白功能和表達影響的研究。 2.細胞毒性試驗 鹽酸度洛西汀在（）10μmol/L時，與細胞培養(yǎng)72h后細胞的存活率大于90％，因此，鹽酸度洛西汀的最大無毒濃度為10μmol/L。 3.鹽酸度洛西汀對羅丹明-123外排的影響 與陰性對照組相比，低、中、高濃度（0.2、5、10μmol/L）的鹽酸度洛西汀顯著降低了羅丹明-123從Caco-2細胞的外排（p<0.05），但不同藥物處理組間差別

6、不明顯。 4.鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白表達的影響 Caco-2細胞與低、中、高濃度（0.2、5、10μmol/L）的鹽酸度洛西汀培養(yǎng)72h后，其熒光強度與陰性對照組相比，沒有顯著性差異。說明試驗濃度的鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白的表達無明顯作用。 （二）鹽酸度洛西汀對他林洛爾人體藥動學的影響 1.他林洛爾的測定 他林洛爾在2.0～240.0 ng/mL濃度范圍內線性關系良好。萃取回收率均大于86.6

7、％，方法回收率為94.3％～105.6％，日內、日間RSD均小于13％，穩(wěn)定性試驗RSD均小于10.5％。 2.鹽酸度洛西汀對他林洛爾藥動學的影響 受試者多劑量服用鹽酸度洛西汀后，他林洛爾的AUC0-60和Cmax由單用時的1348.54 ng·h/mL，91.90 ng/mL分別增加至1498.30ng·h/mL和125.21 ng/mL。AUC和Cmax分別增加了11％和36％。等效性分析顯示兩周期AUC和Cmax比

8、值的90％置信區(qū)間分別為77％-106％和68％-112％，均落于等效范圍之外。他林洛爾的其它藥動學參數Tmax，t1/2，CL/F，V/F在兩周期間并無顯著性差異。 四、結論： 本試驗首次從體內、體外兩方面考察了鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白功能的影響。體外試驗顯示：低、中、高濃度（0.2、5、10μmol/L）的鹽酸度洛西汀均抑制了P-糖蛋白的功能，降低了羅丹明-123從Caco-2細胞中的外排，但是共同培養(yǎng)72h并不影響

9、P-糖蛋白的表達。這說明鹽酸度洛西汀對P-糖蛋白的影響僅為功能上的抑制，其抑制的可能原因為競爭性抑制，或者抑制ATP酶等，其具體機制還需進一步研究。體內試驗顯示：多劑量服用度洛西汀使得他林洛爾的AUC和Cmax增加，提高其生物利用度，但并不影響其他的藥動學參數。我們推測可能的原因是鹽酸度洛西汀抑制了腸道P-糖蛋白的功能，增加了其吸收程度。試驗結果提示我們鹽酸度洛西汀和P-糖蛋白底物合用時可能通過抑制P-糖蛋白功能減少藥物外排，增加其血藥