五酯片對(duì)細(xì)胞色素P450 3A和P-糖蛋白活性影響的研究.pdf

1、五酯片為五味子的乙醇提取制劑，具有抗肝細(xì)胞損傷作用，臨床上用作保肝護(hù)肝藥物使用。環(huán)孢素A和他克莫司，均為細(xì)胞色素P4503A和P-糖蛋白的底物，是臨床上常用的免疫抑制劑，廣泛用于預(yù)防器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生。臨床上，五酯片常用作器官移植病人的保肝護(hù)肝藥物與環(huán)孢素A和他克莫司聯(lián)合使用，以防治免疫抑制劑所致的藥源性肝損害。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，在腎移植病人中，五酯片合用他克莫司后，五酯片可以顯著提高CYP3A和P-gp的底物他克莫司的

2、血藥濃度。那么，五酯片是否能對(duì)同樣是CYP3A和P-gp底物的環(huán)孢素A產(chǎn)生相同的作用呢?能否獲得五酯片影響CYP3A與P-gp活性的直接證據(jù)呢?
　　 因此，本課題擬在整體動(dòng)物水平探討五酯片對(duì)不同劑量環(huán)孢素A藥代動(dòng)力學(xué)的影響，考察五酯片通過(guò)影響CYP3A與P-gp的活性而影響環(huán)孢素A的血藥濃度的程度。另外，本課題通過(guò)使用經(jīng)典的CYP3A與P-gp陽(yáng)性探針?biāo)帲u(píng)價(jià)五酯片同時(shí)對(duì)CYP3A與P-gp活性的影響，從而獲得五酯片影響CYP

3、3A與P-gp活性的直接證據(jù)，為臨床上五酯片與CYP3A與P-gp底物藥物的合理用藥提供科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　 一、建立和確證生物樣品中環(huán)孢素A檢測(cè)的LC-MS/MS方法
　　 目的：建立并確證生物樣品中環(huán)孢素A的LC-MS/MS檢測(cè)方法。
　　 方法：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)全血中環(huán)孢素A的血藥濃度。生物樣品采用硫酸鋅溶液及乙腈兩步沉淀蛋白后進(jìn)行乙酸乙酯液-液萃取法抽提。離子源為電噴霧離子化源(ESI)；檢測(cè)方

4、式為正離子檢測(cè)；掃描方式采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)。色譜分析柱為C18 xTerra MS分析柱(3.5μm,2.1×50 mm Waters，USA)；流動(dòng)相為甲醇-水(含10 mM醋酸銨)(80∶20，v/v)；流速為200μL/min；柱溫為60℃；分析時(shí)間為3 min。
　　 結(jié)果：用于定量分析環(huán)孢素A的離子反應(yīng)分別為m/z1219.9→1203.6(CsA)和m/z809.8→756.6(FK520，內(nèi)標(biāo))。本分析方法

5、中環(huán)孢素A的線性范圍為20～2000ng/mL，方法定量下限為20 ng/mL，生物樣品中環(huán)孢素A的線性相關(guān)程度良好(γ2均大于0.99)。以質(zhì)控樣品計(jì)算該分析方法的批內(nèi)精密度RSD在3.1％～6.3％范圍內(nèi)，批間精密度RSD在6.0％～11.3％范圍內(nèi)；生物樣品的提取回收率在47.8％～53.0％范圍內(nèi)。各項(xiàng)穩(wěn)定性考察結(jié)果表明環(huán)孢素A在所設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定。
　　 結(jié)論：該分析方法經(jīng)方法學(xué)確證結(jié)果滿意，樣品處理及檢測(cè)過(guò)程快速、

6、可靠，可滿足環(huán)孢素A臨床前藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。
　　 二、五酯片對(duì)大鼠體內(nèi)環(huán)孢素A藥動(dòng)學(xué)的影響
　　 目的：在整體動(dòng)物水平探討五酯片對(duì)不同劑量環(huán)孢素A藥代動(dòng)力學(xué)的影響，考察并比較五酯片對(duì)環(huán)孢素A和他克莫司血藥濃度影響程度的異同。
　　 方法：雄性SD大鼠隨機(jī)分組后，分別灌胃給予蒸餾水、五酯片混懸液(0.25 g/kg)或地爾硫卓混懸液(8.1 mg/kg，對(duì)照組)，再灌胃給予環(huán)孢素A(37.8、1.89mg/k

7、g)。采用LC-MS/MS法測(cè)定環(huán)孢素A的血漿濃度，用非房室模型法計(jì)算各主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：?jiǎn)未喂辔附o予五酯片使口服環(huán)孢素A(37.8 mg/kg)的AUC0-48h增加40.1％，Cmax增加13.1％，CL/F從0.6 L/h/kg降低至0.4 L/h/kg。地爾硫卓對(duì)口服環(huán)孢素A(37.8 mg/kg)的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax、AUC、CL/F影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。單次灌胃給予五酯片使口服環(huán)孢

8、素A(1.89 mg/kg)的AUC0-36h增加293.1％，Cmax增加84.1％，CL/F從1.7 L/h/kg降低至0.5 L/h/kg。單次灌胃地爾硫卓使口服環(huán)孢素A(1.89 mg/kg)的AUC0-36h降低37.3％，Cmax降低33.7％、CL/F從1.7 L/h/kg增加至3.8 L/h/kg。
　　 結(jié)論：五酯片通過(guò)影響CYP3A與P-gp的活性來(lái)影響環(huán)孢素A的血藥濃度，五酯片對(duì)降低劑量環(huán)孢素A的血藥濃度及

9、藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)影響更為顯著。
　　 三、同時(shí)評(píng)價(jià)體內(nèi)細(xì)胞色素P4503A和P-糖蛋白活性模型的建立與確證此部分重在建立兩種經(jīng)典CYP3A和P-gp探針的檢測(cè)方法并在動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證此模型。
　　 一)、同時(shí)檢測(cè)CYP3A和P-gp探針的LC-MS/MS檢測(cè)方法
　　 目的：建立同時(shí)檢測(cè)咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖、地高辛的靈敏、特異、可靠的LC-MS/MS定量分析方法。
　　 方法：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法

10、檢測(cè)大鼠血漿中咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖和地高辛的濃度。大鼠血漿樣品加氨水堿化后并采用提取劑(叔丁基甲醚∶二氯甲烷=3∶1)進(jìn)行液液萃取。離子源為電噴霧離子化源(ESI)；檢測(cè)方式為正離子檢測(cè)；掃描方式采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)。色譜分析柱為C18 XTerra MS分析柱(3.5μm,2.1×50 mm,Waters,USA)；流動(dòng)相為甲醇-水(含5 mM甲酸銨+0.1％甲酸)(80∶20，v/v)；流速為200μL/min；分析時(shí)

11、間為3 min。
　　 結(jié)果：咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖、地高辛及內(nèi)標(biāo)洋地黃用于定量分析的離子反應(yīng)m/z分別為325.9、341.9、798.0和782.0，生成的主要碎片離子m/z分別為244.1、168.1、651.0和635.0。血漿中咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖線性范圍均為2～400ng/mL；地高辛線性范圍為0.5～100 ng/mL；分析方法的定量下限咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖為2 ng/mL，地高辛為0.5 n

12、g/mL。以質(zhì)控樣品計(jì)算該分析方法的批內(nèi)、批間精密度RSD均在±15％范圍內(nèi)；生物樣品中咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖、地高辛的提取回收率分別在86.8％～93.3％、84.6％～86.4％、81.7％～85.1％范圍內(nèi)。各項(xiàng)穩(wěn)定性考察結(jié)果表明咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖和地高辛在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定。
　　 二)、評(píng)價(jià)體內(nèi)細(xì)胞色素P4503A和P-糖蛋白活性模型的驗(yàn)證
　　 目的：在整體動(dòng)物水平闡明咪達(dá)唑侖和地高辛兩種探針

13、聯(lián)合給藥無(wú)相互串?dāng)_作用，從而建立一種在動(dòng)物體內(nèi)同時(shí)評(píng)價(jià)CYP3A和P-gp活性的模型。
　　 方法：雄性SD大鼠隨機(jī)分組后，每組大鼠分別灌胃給予地高辛混懸液(0.25mg/kg)，或者灌胃給予咪達(dá)唑侖混懸液(15 mg/kg)，或者灌胃給予咪達(dá)唑侖混懸液(15 mg/kg)，30分鐘后再灌胃給予地高辛混懸液(0.25 mg/kg)，或者同時(shí)灌胃給予咪達(dá)唑侖混懸液(15 mg/kg)和地高辛混懸液(0.25 mg/kg)。采用LC

14、-MS/MS法測(cè)定咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖和地高辛的血漿濃度。用非房室模型法計(jì)算各主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)論：本部分研究建立并確證了同時(shí)檢測(cè)生物樣品中咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖和地高辛的簡(jiǎn)單、靈敏、可靠的LC-MS/MS方法，能滿足兩種探針?biāo)幬锏乃幋鷦?dòng)力學(xué)研究的要求。在整體動(dòng)物水平考察咪達(dá)唑侖和地高辛藥代動(dòng)力學(xué)特征，闡明咪達(dá)唑侖和地高辛聯(lián)合給藥無(wú)相互串?dāng)_作用，從而建立和驗(yàn)證了一種在動(dòng)物體內(nèi)同時(shí)評(píng)價(jià)CY

15、P3A和P-gp活性的模型。
　　 四、五酯片對(duì)細(xì)胞色素P4503A和P-糖蛋白活性的影響
　　 目的：利用第三部分在動(dòng)物體內(nèi)已經(jīng)建立的同時(shí)評(píng)價(jià)CYP3A和P-gp活性的模型來(lái)研究五酯片對(duì)咪達(dá)唑侖、地高辛藥代動(dòng)力學(xué)的影響，獲得五酯片影響CYP3A和P-gp活性的直接證據(jù)。
　　 方法：雄性SD大鼠隨機(jī)分成組后，分別灌胃給予蒸餾水、五酯片(0.25 g/kg)，再灌胃給予咪達(dá)唑侖混懸液(15 mg/kg)，30分鐘

16、后再灌胃給予地高辛混懸液(0.25 mg/kg)。于給前(0 h)、給藥(咪達(dá)唑侖)后0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12 h從右頸靜脈取血約0.25 mL。用非房室模型法計(jì)算各主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：與單獨(dú)服用咪達(dá)唑和地高辛侖組相比，五酯片使口服咪達(dá)唑侖及地高辛的血藥濃度升高，使咪達(dá)唑侖AUC0-4h升高34.5％、Cmax增加13.4％，CL/F

17、從18.5L/h/kg降低至5.8 L/h/kg，使地高辛AUC0-12h升高55.1％、Cmax增加74.9％，CL/F從2.6L/h/kg降低至1.7L/h/kg。與單獨(dú)服用咪達(dá)唑侖和地高辛組相比，五酯片對(duì)1'-羥基咪達(dá)唑侖的血藥濃度及主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)沒(méi)有顯著影響。
　　 結(jié)論：本部分研究表明，五酯片抑制了CYP3A和P-gp的活性從而使得咪達(dá)唑侖和地高辛的血藥濃度升高。從而獲得五酯片影響CYP3A與P-gp活性的直接證據(jù)

18、。
　　 綜上所述，五酯片對(duì)CYP3A和P-gp底物環(huán)孢素A及經(jīng)典探針?biāo)庍溥_(dá)唑侖和地高辛的血藥濃度均有影響，但五酯片對(duì)降低劑量環(huán)孢素A的血藥濃度影響更為顯著。利用經(jīng)典的陽(yáng)性探針?biāo)幫瑫r(shí)評(píng)價(jià)五酯片對(duì)體內(nèi)CYP3A與P-gp活性影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五酯片抑制了CYP3A和P-gp的活性從而使得咪達(dá)唑侖和地高辛的血藥濃度升高。以上研究結(jié)果可獲得五酯片影響CYP3A和P-gp活性的直接證據(jù)，為臨床上五酯片與CYP3A與P-gp底物藥物的合