深海角蛋白降解菌Bacillus aquimaris JM7的發(fā)酵條件優(yōu)化及功能基因的克隆表達(dá).pdf

1、隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大，羽毛作為家禽的副產(chǎn)物的大量堆積不僅造成環(huán)境破壞、病原微生物滋生，還會(huì)造成角蛋白資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。本研究采用條件溫和、工藝環(huán)保的微生物法降解羽毛角蛋白，利用液體發(fā)酵法探究菌株降解羽毛的最優(yōu)化條件，并對(duì)角蛋白酶基因進(jìn)行克隆，進(jìn)一步在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行融合表達(dá)，擬實(shí)現(xiàn)角蛋白酶的外源表達(dá)。
　　1.以羽毛為唯一碳、氮源篩選到一株高效降解角蛋白的菌株海水芽孢桿菌Bacillus aquimaris JM7。對(duì)Bacil

2、lus aquimaris JM7以羽毛為底物的發(fā)酵條件進(jìn)行了單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Bacillus aquimaris JM7降解羽毛最適發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH值為9.0；菌接種量4％（v/v）；培養(yǎng)溫度40℃；搖床轉(zhuǎn)速150rpm；羽毛粉添加量為0.2%（m/v）；額外添加氮源及蔗糖對(duì)菌株降解羽毛粉均有抑制作用。上述條件下培養(yǎng)30h后，羽毛粉降解率達(dá)74.5%，高于多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道水平。Bacillus aquimar

3、is JM7降解羽毛主要產(chǎn)生谷氨酸、絲氨酸、脯氨酸等17種氨基酸。
　　2.對(duì)角蛋白酶基因Ker02562進(jìn)行了克隆、表達(dá)和純化。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增了角蛋白酶基因，其全長(zhǎng)為963 bp，編碼了一個(gè)由320個(gè)氨基酸殘基組成、預(yù)計(jì)分子量為34.181kDa的蛋白質(zhì)。構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明，重組角蛋白酶E. coli-pCold I-Ker02562的分子量為38kDa左

4、右（角蛋白酶34kDa，pCold I自身標(biāo)簽4kD左右），和預(yù)測(cè)分子量一致。
　　3.對(duì)純化后的角蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明：
　?。?）酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，在10-50℃條件下熱穩(wěn)定性良好；最適pH為7.0-10.0，該條件下酶能保持90%以上的活性；
　?。?）金屬離子Ca2+，F(xiàn)e2+，Sr2+對(duì)酶活具有促進(jìn)作用；
　?。?）濃度為5mM的PMSF和1mM、5mM的EDTA對(duì)酶活有抑制作用，說明該酶