改良固相BANA試驗方法的建立及在牙周病變檢測中的應(yīng)用.pdf

1、目的：牙齦卟啉單胞菌、福賽氏類桿菌、螺旋體是三種公認(rèn)的牙周炎重要可疑致病微生物。Loesches研究證實齦下菌斑中以上三種致病微生物均能產(chǎn)生胰蛋白酶樣酶(Trypsin-likeenzyme，TLE)，胰蛋白酶樣酶是牙周組織的重要破壞因素之一。BANA試驗(bengoyl-DL-arginine-naphthlamide，BANA))是利用牙齦卟啉單胞菌、齒密螺旋體、福賽氏類桿菌均能產(chǎn)生胰蛋白酶樣酶，可使人工合成的酶底物—苯甲酰精氨酸萘

2、酰胺(bengoyl-DL-arginine-naphthlamide)水解的原理，建立的檢測這三種牙周炎重要可疑致病微生物的方法。本研究以液相BANA方法為“參照標(biāo)準(zhǔn)”，旨在確定改良固相BANA試驗檢測方法的最適反應(yīng)條件，探索改良固相BANA試驗的敏感性、特異性，建立更方便于臨床、穩(wěn)定的固相BANA試驗的技術(shù)方案，評價該方法應(yīng)用于臨床的價值，初步探討改良固相BANA試驗結(jié)果與牙周炎主要臨床指標(biāo)之間的關(guān)系。 材料與方法1細(xì)菌的培

3、養(yǎng)試驗菌株選用口腔重要國際標(biāo)準(zhǔn)菌株20株，其中厭氧菌14株，需氧菌6株，分別進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)獲得細(xì)菌懸液，分別用于固、液相BANA試驗。 2臨床資料白求恩國際和平醫(yī)院口腔科門診就診患者，刮取齦下菌斑標(biāo)本。共采集齦下菌斑標(biāo)本(來自齦溝或牙周袋)205份。 3記錄臨床指數(shù)菌斑指數(shù)(PLI)，牙齦指數(shù)(GI)，牙周袋最大探診深度，牙齒松動度，附著喪失，牙槽骨吸收程度。 4液相BANA試驗：100μl待檢菌液或菌斑標(biāo)本

4、進(jìn)行液相BANA試驗5改良固相BANA試驗： 10μl待檢菌液或菌斑標(biāo)本進(jìn)行改良固相BANA試驗結(jié)果1改良固相BANA試驗最適工作條件確定：2mM的BANA的為改良固相BANA試驗最適工作濃度，發(fā)現(xiàn)最適工作條件為55℃水箱孵育30分鐘，在此濃度時可檢測出1.95×10-6以上Anson單位的胰蛋白酶。 2兩種BANA試驗特異性評價牙齦卟啉單胞菌兩種BANA試驗呈陽性(++至+++)，黃褐噬二氧化碳纖維菌、牙齦噬二氧化碳纖

5、維菌、銅綠假單胞菌為弱陽性(+)；其它14株待檢菌株反應(yīng)陰性(-)。 3兩種BANA試驗敏感性的比較測定結(jié)果顯示當(dāng)固相法在55℃孵育30分鐘時可檢出1.95×10-6以上Anson單位的胰蛋白酶；液相法在37℃，孵育過夜后可檢出1.563×10-6以上Anson單位的胰蛋白酶，兩種試驗方法的敏感性幾乎相同，但固相法更快捷、方便。 當(dāng)牙齦卟啉單胞菌菌液濃度高于8.0×105時，兩種BANA試驗均反應(yīng)為陽性。 4改良

6、固相BANA試驗與液相BANA試驗及“臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)”在慢性牙周炎活動期的診斷符合率。 經(jīng)統(tǒng)計學(xué)一致性檢驗，Kappa指數(shù)=0.869565，P＜0.01，說明固相BANA與液相BANA試驗兩種方法在慢性牙周炎活動期診斷上存在一致性。 5健康牙齦組、單純性牙齦炎組、慢性牙周炎活動期組齦下菌斑固相BANA試驗結(jié)果 健康牙齦組、慢性單純性牙齦炎組、慢性牙周炎活動期組齦下菌斑固相BANA試驗陽性率分別為6％、13.3％、

7、86.67％，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)x2檢驗，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 三組齦下菌斑固相BANA試驗結(jié)果的分值經(jīng)Nemenyi秩和檢驗進(jìn)行三組間兩兩比較，健康組與牙齦炎組間P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義，牙周炎組與健康組和牙齦炎組之間P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 6臨床指數(shù)與齦下菌斑固相BANA測定值的關(guān)系6.1菌斑指數(shù)與齦下菌斑固相BANA試驗測定值的關(guān)系不同菌斑指數(shù)所對應(yīng)的固相BANA測定值，經(jīng)秩和檢驗P＜0.05，提示

8、不同菌斑指數(shù)所對應(yīng)的齦下菌斑固相BANA試驗測定值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 菌斑指數(shù)與齦下菌斑固相BANA測定值的關(guān)系經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗r=0.4233、0.01＜P＜0.05提示菌斑指數(shù)與齦下菌斑固相BANA測定值在統(tǒng)計學(xué)上存在正相關(guān)。 6.2牙齦指數(shù)與齦下菌斑固相BANA試驗測定值的關(guān)系牙齦指數(shù)不同分值所對應(yīng)的齦下菌斑固相BANA測定值，經(jīng)秩和檢驗P＜0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 牙齦指數(shù)與齦下菌斑固

9、相BANA試驗測定值的關(guān)系經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗r=0.8141，P＜0.05提示牙齦指數(shù)與齦下菌斑固相BANA測定值在統(tǒng)計學(xué)上存在正相關(guān)。 6.3齦溝/牙周袋最大探診深度與齦下菌斑固相BANA試驗測定值的關(guān)系 將齦溝/牙周袋深度作計量資料時，不同齦溝/牙周袋最大探診深度所對應(yīng)齦下菌斑固相BANA測定值經(jīng)秩和檢驗P＜0.05，提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 齦下菌斑標(biāo)本固相BANA試驗測定值與齦溝/牙周袋最大探診深

10、度的關(guān)系，經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗r=0.74，P＜0.05，提示齦溝/牙周袋最大探診深度與齦下菌斑固相BANA測定值在統(tǒng)計學(xué)上存在正相關(guān)。 6.4牙齒松動度與齦下菌斑標(biāo)本固相BANA試驗測定值的關(guān)系 不同程度松動度所對應(yīng)齦下菌斑固相BANA測定值經(jīng)秩和檢驗P＜0.05，提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 牙齒松動度與固相BANA測定值的關(guān)系經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗r=0.6816，P＜0.01，提示牙齒松動度與固相

11、BANA測定值在統(tǒng)計學(xué)上存在正相關(guān)。 6.5附著喪失程度與齦下菌斑標(biāo)本固相BANA試驗測定值的關(guān)系 附著喪失程度與齦下菌斑標(biāo)本固相BANA試驗測定值的關(guān)系經(jīng)秩和檢驗P＜0.05，提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 經(jīng)統(tǒng)計學(xué)Spearman秩相關(guān)檢驗r=0.7439、P＜0.01，說明附著喪失程度與齦下菌斑標(biāo)本固相BANA試驗測定值在統(tǒng)計學(xué)上存在正相關(guān)，隨著附著喪失程度的增加，固相BANA試驗測定值有上升趨勢。 6.6

12、牙槽骨吸收程度與齦下菌斑標(biāo)本固相BANA試驗測定值的關(guān)系 牙槽骨吸收程度與相應(yīng)齦下菌斑標(biāo)本固相BANA試驗測定值的關(guān)系經(jīng)秩和檢驗P＜0.05，提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 經(jīng)統(tǒng)計學(xué)Spearman秩相關(guān)檢驗r=0.6308、P＜0.01，說明牙槽骨吸收程度與齦下菌斑標(biāo)本固相BANA試驗測定值在統(tǒng)計學(xué)上存在正相關(guān). 不同菌斑指數(shù)、牙齦指數(shù)、齦溝/牙周袋最大探診深度、牙齒松動度、附著喪失程度、牙槽骨吸收程度所對應(yīng)的固相BA

13、NA測定值，經(jīng)秩和檢驗P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 菌斑指數(shù)、牙齦指數(shù)、齦溝/牙周袋最大探診深度、牙齒松動度、附著喪失程度、牙槽骨吸收程度與齦下菌斑固相BANA測定值的關(guān)系，經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗P＜0.05提示菌斑指數(shù)與齦下菌斑固相BANA測定值在統(tǒng)計學(xué)上存在正相關(guān)。 結(jié)論1建立了新的、改良的固相BANA試驗技術(shù)方案，簡化了工作流程。實驗發(fā)現(xiàn)2mM的BANA的為改良固相BANA試驗最適工作濃度，最適工作條件為

14、55℃水箱孵育30分鐘。 2本試驗顯示兩種BANA試驗方法均可檢出8.0×105以上的牙齦卟啉單胞菌，提示BANA試驗檢測牙周病關(guān)鍵厭氧菌的特異性、敏感性較好。但固相法具有更簡單、方便、直觀的優(yōu)勢。 3慢性牙周炎活動期齦下菌斑改良固相BANA試驗陽性率明顯高于健康牙齦組和慢性單純性牙齦炎組，而健康牙齦組和慢性單純性牙齦炎組兩者之間無差異。 慢性牙周炎活動期組齦下菌斑改良固相BANA試驗測定值高于牙齦健康組和牙齦炎

15、組，說明該三種關(guān)鍵致病菌的水平增高是導(dǎo)致牙周病變的重要相關(guān)因素之一。 4齦下菌斑改良固相BANA試驗測定值與牙齦指數(shù)、附著喪失、牙周袋最大探診深度、在統(tǒng)計學(xué)及臨床上均存在正相關(guān)，提示牙齦指數(shù)、附著喪失、牙周袋最大探診深度與牙周病活動性有關(guān)；表示菌斑指數(shù)、牙齒松動度、牙槽骨吸收程度與改良固相BANA關(guān)系密切程度的確定系數(shù)(r2)的數(shù)值分別為0.1792、0.3979、0.4645，提示齦下菌斑改良固相BANA試驗測定值與菌斑指數(shù)、