HIF-1α對細胞缺氧損傷的保護作用及其機制的初步研究.pdf

1、缺氧(hypoxia)是一種常見的病理過程。雖然不同類型細胞對缺氧的敏感性不同，但是，隨著缺氧嚴重程度和持續(xù)時間的增加，最終都會引起細胞的代謝和功能障礙，甚至死亡。細胞為了對抗這種缺氧損傷反應，可以通過氧感受器和相關的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，啟動一系列內(nèi)源性保護機制。大量研究結(jié)果提示，缺氧誘導因子1(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)可能是這種內(nèi)源性保護機制的中心環(huán)節(jié)，但有關作用機制尚不十分清楚。 HIF-1是

2、介導缺氧信號與眾多缺氧誘導基因轉(zhuǎn)錄激活的一個重要的耦聯(lián)和調(diào)控因子，對于低氧環(huán)境中細胞的生存具有重要意義。HIF-1作為反式作用因子與細胞核染色體上的順式作用元件(缺氧反應元件)相互作用，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些基因產(chǎn)物可通過提高糖酵解效率、促進血管生成和增加葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種途徑來維持細胞在缺氧環(huán)境中的生存，對抗缺氧損傷。有關HIF-1及調(diào)控基因表達產(chǎn)物功能及作用的研究是當前的前沿和熱點?，F(xiàn)在還有一些新HIF-1調(diào)控的基因被不斷發(fā)現(xiàn)

3、，說明HIF-1抗缺氧損傷的發(fā)生是多因素、多步驟、綜合作用的結(jié)果。為了研究HIF-1對缺氧損傷的保護作用及其發(fā)生機制，我們應用基因同源重組原理，構(gòu)建了能介導HIF-1α基因轉(zhuǎn)染和表達的復制缺陷型重組腺病毒載體Ad-HIF-1α；通過腺病毒中介外源基因HIF-1α在細胞內(nèi)的高表達，從細胞水平研究復制缺陷型腺病毒Ad-HIF-1α對細胞缺氧損傷的保護作用，并用分子生物學方法和基因芯片技術(shù)對其作用機制進行初步探討。 方法： 1

4、.利用基因同源重組技術(shù)，采用pAdEasy腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建HIF-1α重組腺病毒(Ad--HIF-1α)和對照腺病毒(Ad-GFP)。通過GFP熒光表達、PCR等方法鑒定構(gòu)建的腺病毒載體并測定重組腺病毒的滴度。 2.重組腺病毒Ad-HIF-1α轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HepG2細胞，應用RT-PCR和WesternBlot等方法觀測目的基因在HepG2細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。 3.HepG2細胞常氧培養(yǎng)24h后，分為4組：①對照腺病毒轉(zhuǎn)

5、染常氧組(CC組)：換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入對照腺病毒(MOI=75)，繼續(xù)常氧培養(yǎng)48h；②HIF-1α腺病毒轉(zhuǎn)染常氧組(CH組)：換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入HIF-1α[腺病毒(MOI=75)，繼續(xù)常氧培養(yǎng)48h；③對照腺病毒轉(zhuǎn)染低氧組(HC組)：換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入對照腺病毒(MOI=75)，常氧培養(yǎng)24h后，低氧(2％氧)培養(yǎng)24h；④HIF-1α腺病毒轉(zhuǎn)染低氧組(HH組)：換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入HIF-1α腺病毒(MOI=

6、75)，常氧培養(yǎng)24h后，低氧(2％氧)培養(yǎng)24h。 4.觀察上述各組細胞的細胞活力，LDH釋放率，細胞內(nèi)NO和ROS含量及iNOS酶的活力。 5.利用基因芯片技術(shù)，結(jié)合生物信息學分析方法，以CC組為對照組，觀察CH、HC、HH組細胞基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了HIF-1α重組腺病毒和對照腺病毒，純化后病毒滴度分別為1.15×1010pfu/ml和8×1010pfu/ml。GFP熒光表達、

7、PCR等方法證明目的基因存在于所構(gòu)建的載體中，并能有效的介導HIF-1α的表達。 2.Ad-HIF-1α轉(zhuǎn)染的HepG2細胞，可高效表達HIF-1α，Ad-GFP轉(zhuǎn)染的HepG2細胞中HIF-1α微弱表達。 3.HC組的細胞活力顯著低于CC組，LDH釋放率顯著高于CC組；CH組的細胞活力和LDH釋放率與HH組無顯著差異；HH組的細胞活力顯著高于HC組。 4.HC組細胞內(nèi)ROS含量顯著高于CC組；CH細胞內(nèi)ROS含

8、量與CC組無顯著差異；HH細胞內(nèi)ROS含量與CH組或HC組比較均無顯著差異。 5.CH組細胞內(nèi)NO含量和iNOS酶活力顯著高于CC組；HC組細胞內(nèi)NO含量和iNOS酶活力顯著高于CC組；HH組細胞內(nèi)NO含量和iNOS酶活力與HC組無顯著差異；HH組細胞內(nèi)NO的含量和iNOS的酶活力與CH組無顯著差異。 6.經(jīng)基因表達譜芯片分析，與CC組比較，CH組細胞內(nèi)有3種基因的表達下調(diào)，HC組細胞內(nèi)有10種基因的表達上調(diào)；HH組細胞

9、內(nèi)有6種基因的表達上調(diào)、1種基因的表達下調(diào)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了高滴度的復制缺陷型Ad-HIF-1α腺病毒，體外轉(zhuǎn)染HepG2細胞后HIF-1αmRNA和蛋白表達顯著增高。 2.2％低氧可對HepG2細胞產(chǎn)生損傷作用，細胞活力顯著下降，LDH釋放率顯著升高；基礎性HIF-1α高表達可顯著減輕低氧對HepG2細胞的損傷。 3.基礎性HIF-1α高表達有利于提高細胞對缺氧的耐受能力，其機制：①可能與HIF

10、-1α高表達提高HIF-1調(diào)控的缺氧相關基因的基礎表達水平和其產(chǎn)物含量有關；②可能與防止缺氧時ROS等損傷因素的過度增加有關。 4.低氧培養(yǎng)時HepG2細胞內(nèi)多種凋亡/抗凋亡基因、能量代謝相關基因的表達上調(diào)；常氧培養(yǎng)時，HIF-1α高表達HepG2細胞內(nèi)天冬氨酰葡糖苷酶和精氨酸甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶表達下調(diào)，可能有助于降低產(chǎn)能底物的消耗，儲備能源物質(zhì)；基礎性HIF-1α高表達的HepG2細胞低氧培養(yǎng)時，葡萄糖轉(zhuǎn)運體表達的上調(diào)和精氨酸甘