HIF-1α對(duì)細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、缺氧(hypoxia)是一種常見(jiàn)的病理過(guò)程。雖然不同類型細(xì)胞對(duì)缺氧的敏感性不同，但是，隨著缺氧嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間的增加，最終都會(huì)引起細(xì)胞的代謝和功能障礙，甚至死亡。細(xì)胞為了對(duì)抗這種缺氧損傷反應(yīng)，可以通過(guò)氧感受器和相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，啟動(dòng)一系列內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。大量研究結(jié)果提示，缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)可能是這種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，但有關(guān)作用機(jī)制尚不十分清楚。 HIF-1是

2、介導(dǎo)缺氧信號(hào)與眾多缺氧誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄激活的一個(gè)重要的耦聯(lián)和調(diào)控因子，對(duì)于低氧環(huán)境中細(xì)胞的生存具有重要意義。HIF-1作為反式作用因子與細(xì)胞核染色體上的順式作用元件(缺氧反應(yīng)元件)相互作用，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些基因產(chǎn)物可通過(guò)提高糖酵解效率、促進(jìn)血管生成和增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種途徑來(lái)維持細(xì)胞在缺氧環(huán)境中的生存，對(duì)抗缺氧損傷。有關(guān)HIF-1及調(diào)控基因表達(dá)產(chǎn)物功能及作用的研究是當(dāng)前的前沿和熱點(diǎn)。現(xiàn)在還有一些新HIF-1調(diào)控的基因被不斷發(fā)現(xiàn)

3、，說(shuō)明HIF-1抗缺氧損傷的發(fā)生是多因素、多步驟、綜合作用的結(jié)果。為了研究HIF-1對(duì)缺氧損傷的保護(hù)作用及其發(fā)生機(jī)制，我們應(yīng)用基因同源重組原理，構(gòu)建了能介導(dǎo)HIF-1α基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體Ad-HIF-1α；通過(guò)腺病毒中介外源基因HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)，從細(xì)胞水平研究復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-HIF-1α對(duì)細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用，并用分子生物學(xué)方法和基因芯片技術(shù)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 1

4、.利用基因同源重組技術(shù)，采用pAdEasy腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建HIF-1α重組腺病毒(Ad--HIF-1α)和對(duì)照腺病毒(Ad-GFP)。通過(guò)GFP熒光表達(dá)、PCR等方法鑒定構(gòu)建的腺病毒載體并測(cè)定重組腺病毒的滴度。 2.重組腺病毒Ad-HIF-1α轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR和WesternBlot等方法觀測(cè)目的基因在HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯。 3.HepG2細(xì)胞常氧培養(yǎng)24h后，分為4組：①對(duì)照腺病毒轉(zhuǎn)

5、染常氧組(CC組)：換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入對(duì)照腺病毒(MOI=75)，繼續(xù)常氧培養(yǎng)48h；②HIF-1α腺病毒轉(zhuǎn)染常氧組(CH組)：換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入HIF-1α[腺病毒(MOI=75)，繼續(xù)常氧培養(yǎng)48h；③對(duì)照腺病毒轉(zhuǎn)染低氧組(HC組)：換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入對(duì)照腺病毒(MOI=75)，常氧培養(yǎng)24h后，低氧(2％氧)培養(yǎng)24h；④HIF-1α腺病毒轉(zhuǎn)染低氧組(HH組)：換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入HIF-1α腺病毒(MOI=

6、75)，常氧培養(yǎng)24h后，低氧(2％氧)培養(yǎng)24h。 4.觀察上述各組細(xì)胞的細(xì)胞活力，LDH釋放率，細(xì)胞內(nèi)NO和ROS含量及iNOS酶的活力。 5.利用基因芯片技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，以CC組為對(duì)照組，觀察CH、HC、HH組細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了HIF-1α重組腺病毒和對(duì)照腺病毒，純化后病毒滴度分別為1.15×1010pfu/ml和8×1010pfu/ml。GFP熒光表達(dá)、

7、PCR等方法證明目的基因存在于所構(gòu)建的載體中，并能有效的介導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)。 2.Ad-HIF-1α轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞，可高效表達(dá)HIF-1α，Ad-GFP轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中HIF-1α微弱表達(dá)。 3.HC組的細(xì)胞活力顯著低于CC組，LDH釋放率顯著高于CC組；CH組的細(xì)胞活力和LDH釋放率與HH組無(wú)顯著差異；HH組的細(xì)胞活力顯著高于HC組。 4.HC組細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著高于CC組；CH細(xì)胞內(nèi)ROS含

8、量與CC組無(wú)顯著差異；HH細(xì)胞內(nèi)ROS含量與CH組或HC組比較均無(wú)顯著差異。 5.CH組細(xì)胞內(nèi)NO含量和iNOS酶活力顯著高于CC組；HC組細(xì)胞內(nèi)NO含量和iNOS酶活力顯著高于CC組；HH組細(xì)胞內(nèi)NO含量和iNOS酶活力與HC組無(wú)顯著差異；HH組細(xì)胞內(nèi)NO的含量和iNOS的酶活力與CH組無(wú)顯著差異。 6.經(jīng)基因表達(dá)譜芯片分析，與CC組比較，CH組細(xì)胞內(nèi)有3種基因的表達(dá)下調(diào)，HC組細(xì)胞內(nèi)有10種基因的表達(dá)上調(diào)；HH組細(xì)胞

9、內(nèi)有6種基因的表達(dá)上調(diào)、1種基因的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了高滴度的復(fù)制缺陷型Ad-HIF-1α腺病毒，體外轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)顯著增高。 2.2％低氧可對(duì)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用，細(xì)胞活力顯著下降，LDH釋放率顯著升高；基礎(chǔ)性HIF-1α高表達(dá)可顯著減輕低氧對(duì)HepG2細(xì)胞的損傷。 3.基礎(chǔ)性HIF-1α高表達(dá)有利于提高細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受能力，其機(jī)制：①可能與HIF

10、-1α高表達(dá)提高HIF-1調(diào)控的缺氧相關(guān)基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平和其產(chǎn)物含量有關(guān)；②可能與防止缺氧時(shí)ROS等損傷因素的過(guò)度增加有關(guān)。 4.低氧培養(yǎng)時(shí)HepG2細(xì)胞內(nèi)多種凋亡/抗凋亡基因、能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)；常氧培養(yǎng)時(shí)，HIF-1α高表達(dá)HepG2細(xì)胞內(nèi)天冬氨酰葡糖苷酶和精氨酸甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)，可能有助于降低產(chǎn)能底物的消耗，儲(chǔ)備能源物質(zhì)；基礎(chǔ)性HIF-1α高表達(dá)的HepG2細(xì)胞低氧培養(yǎng)時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的上調(diào)和精氨酸甘