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1、第一章、E1A基因通過下調(diào)人鼻咽癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和提高野生型p53基因的表達(dá)來提高放射治療的敏感性
　　 目的：探討腺病毒E1A基因?qū)θ吮茄拾〤NE-2Z細(xì)胞放射治療的增敏作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：選用人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞為靶細(xì)胞,分別用PBS,Ad-β-gal,Ad-E1A作用48小時(shí)后,用6MVX線分別給與0、2、4、6和8Gy劑量照射后,用MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞成活率及細(xì)胞周期變化,并

2、進(jìn)行克隆分析繪制細(xì)胞存活曲線,計(jì)算放射增敏比來觀察E1A基因?qū)θ吮茄拾〤NE-2Z細(xì)胞放射敏感性的影響,同時(shí)用RT-PCR法檢測(cè)三組細(xì)胞的VEGF水平的表達(dá)及野生型p53的表達(dá)。細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)三組細(xì)胞的VEGF蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果： RT-PCR結(jié)果顯示Ad-E1A組可以檢測(cè)到E1A基因的表達(dá)。經(jīng)照射后Ad-E1A組的細(xì)胞存活率明顯低于PBS對(duì)照組和Ad-β-gal對(duì)照組。Ad-E1A組的細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯慢于PBS對(duì)

3、照組和Ad-β-gal對(duì)照組。細(xì)胞存活曲線結(jié)果顯示Ad-E1A組的CNE-2Z細(xì)胞放射增敏比分別為1.37(D0值比)、1.95(Dq值比)、1.46(SF2比)。PBS對(duì)照組和Ad-β-gal對(duì)照組的細(xì)胞照射后細(xì)胞存活曲線分析結(jié)果顯示無差異,D0、Dq、SF2值分別為1.57Gy及1.53Gy、1.82Gy及1.78Gy、0.89及0.82。RT-PCR結(jié)果和細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示Ad-E1A組比PBS對(duì)照組和Ad-β-gal對(duì)照組的人

4、鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的VEGF的表達(dá)明顯下降,RT-PCR結(jié)果顯示Ad-E1A組比PBS對(duì)照組和Ad-β-gal對(duì)照組的野生型p53水平明顯上升。流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示Ad-E1A組+放射治療組細(xì)胞的凋亡明顯高于其他組。
　　 結(jié)論： E1A基因通過下調(diào)人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞VEGF的表達(dá)和上調(diào)野生型p53的表達(dá)來增加人鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性。
　　 第二章、E1A基因?qū)θ吮茄拾﹦?dòng)物模型放射增敏的實(shí)驗(yàn)研究
　

5、　 目的:探討腺病毒E1A基因?qū)θ吮茄拾﹦?dòng)物模型放射增敏的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2Z細(xì)胞5×105/0.2mL,接種于4周齡左右裸鼠右前肢腋部皮下致瘤,第7天裸鼠皮下腫瘤長(zhǎng)至直徑0.6～0.8cm時(shí),隨機(jī)分為6組(每組10個(gè)):PBS組,Ad-β-gal組,放射組,Ad-β-gal+放射組,Ad-E1A組,Ad-E1A+放射組。Ad-β-gal組/Ad-E1A組在第2周開始給予荷瘤裸鼠皮下腫瘤內(nèi)滴度為5

6、×109PFU/50μL的Ad-E1A/Ad-β-gal注射,每周2次,連續(xù)2周,放射組在第3周給予6MV-X照射,每天2Gy,連續(xù)5天。Ad-β-gal+放射組/Ad-E1A+放射組在第2周開始,給予荷瘤裸鼠皮下腫瘤內(nèi)滴度為5×109PFU/50μL的Ad-E1A/Ad-β-gal注射,每周2次,連續(xù)2周,在第3周給予6MV-X照射,每天2Gy,連續(xù)5天。第1次治療后,每隔4天用卡尺測(cè)量1次腫瘤的體積,記錄其直徑,裸鼠的生存時(shí)間。當(dāng)腫

7、瘤的直徑超過2cm時(shí),處死裸鼠,分離腫瘤組織,采用免疫組織化學(xué)方法分析VEGF和CD34表達(dá),RT-PCR分析wtp53的表達(dá),Western blot分析VEGF的表達(dá),TUNEL分析細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果:Ad-E1A+放射組較其他組能明顯延緩移植瘤生長(zhǎng)時(shí)間,Ad-E1A+放射組裸鼠的腫瘤平均體積比單獨(dú)放射組小4.7倍,比單獨(dú)Ad-E1A組的小5.3倍。Ad-E1A+放射組的裸鼠生存率顯著高于其他治療組。Ad-E1A+放射組

8、的VEGF蛋白表達(dá)和微血管密度較其他各組明顯下降。(P＜0.01)。Ad-E1A組和Ad-E1A+放射組的wtp53基因表達(dá)明顯上調(diào)。TUNEL分析結(jié)果顯示Ad-E1A組和Ad-E1A+放射組及放射組的腫瘤組織內(nèi)均可明顯觀察到凋亡細(xì)胞。并且,Ad-E1A+放射組腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯高于Ad-E1A組或單獨(dú)放射組。
　　 結(jié)論:E1A基因通過抑制腫瘤血管的形成和上調(diào)腫瘤組織中wtp53的表達(dá)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來提高人鼻咽癌細(xì)胞對(duì)