登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3 NTPase-RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)、活性研究及拮抗肽篩選.pdf

1、登革病毒(denguevirus)是人類登革熱(DF)、登革出血熱/登革休克綜合征(DHF/DSS)的病原體。登革病毒感染嚴(yán)重威脅全球近半數(shù)人的健康，然而時至今日仍然沒有有效的治療藥物和疫苗，因而探索抗登革病毒感染的新策略成為當(dāng)今登革研究的熱點(diǎn)。登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3，其編碼基因在黃病毒中具有高度的保守性，基因全長1854bp,編碼618個氨基酸，是病毒編碼的第二大蛋白。NS3是一種多功能蛋白，N端具有Ser蛋白酶活性，C端具RNA解

2、旋酶及NTPase、5′RNA三磷酸酶等活性，參與病毒前體的加工和病毒RNA的復(fù)制及基因組RNA的5′端加帽。該蛋白具有很好的免疫原性，并存在特異性CD4+和CD8+識別表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。鑒于NS3同時具有病毒復(fù)制所必需的多種酶活性及其良好的免疫原性，其已成為登革抗病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶標(biāo)。本研究工作分為以下三個部分： 1)DENNS3表達(dá)體系的構(gòu)建：提取感染登革2型病毒的C6/36細(xì)胞總RNA，

3、RT-PCR擴(kuò)增目的基因，雙酶切后連入表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-NS3、pET28a-dNS3，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE和免疫印跡鑒定表達(dá)蛋白。通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域(dNS3)在大腸桿菌中獲得可溶性表達(dá)。 2)重組蛋白NTPase活性和抗原性分析：表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化，超濾濃縮脫鹽，孔雀綠鉬酸銨法檢測NTPase活性。純化產(chǎn)物經(jīng)測定具

4、有良好的NTPase活性及抗原性，dNS3對其底物(ATP、CTP、GTP、UTP)存在不同的底物親嗜性。體外條件下，發(fā)現(xiàn)登革2型病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5(RDRP)及polyA對dNS3的ATPase活性有促進(jìn)作用，提示在病毒復(fù)制時，NS3與NS5間的相互作用可能對NS3的NTPase活性有調(diào)控作用。 3)NS3蛋白小分子結(jié)合肽的篩選：以NS3蛋白為配體，從噬菌體隨機(jī)多肽文庫中，篩選出能與NS3蛋白NTPase/RNAhelica

5、se結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的短肽分子，進(jìn)行了3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的篩選。從第3輪篩選后得到的噬斑中隨機(jī)挑選20個克隆，用ELISA法測定上清液中噬菌體與DEN-2dNS3結(jié)合活性。其中有8株ELISA的吸光度值較高。 從篩選得到的陽性克隆菌株提取單鏈DNA，進(jìn)行DNA序列測定并推導(dǎo)這些DNA序列編碼的氨基酸殘基，即為噬菌體遞呈的肽序列。本實(shí)驗(yàn)篩選得到肽氨基酸序列大多含有TPS/SPT序列，富含絲氨酸、蘇氨酸等親水性氨基酸。實(shí)驗(yàn)所用