非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在登革病毒感染早期診斷及分型診斷中的作用.pdf

1、目前，登革病毒(DV)廣泛流行于全世界100多個國家和地區(qū)，據(jù)WHO估計，全球每年約有5千萬至1億人感染登革病毒。我國南方近年來也頻發(fā)小流行，僅2002年廣州和澳門地區(qū)就有近萬人感染。登革熱已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害人類健康的蚊媒傳播疾病，被認(rèn)為是急需引起重視的一種再現(xiàn)突發(fā)性傳染性疾病。登革病毒分為4個血清型，DV1～DV4，任何型別的登革病毒感染均可引起一系列的臨床癥狀，包括隱性感染、發(fā)熱、登革熱(DF)及更為嚴(yán)重的登革出血熱(DHF)和登

2、革休克綜合征(DSS)。登革病毒的初次感染對于同型病毒的再次感染可產(chǎn)生長久的免疫力，但對于其它型別登革病毒的再次感染則僅有部分而短暫的免疫保護(hù)作用。血清流行病學(xué)的調(diào)查研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，異型病毒的再次感染是引發(fā)DHF/DSS的高危因素。目前具有保護(hù)性的登革病毒疫苗尚未研制成功，臨床上對于登革病毒的感染亦未有特異性的治療措施，但研究表明及早的臨床處理可以減少DHF的發(fā)病率和致死率。由于多數(shù)登革病毒感染者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，僅有發(fā)熱、寒戰(zhàn)等流

3、感樣癥狀，難以和其它發(fā)熱疾病和出血熱疾病區(qū)分，必須依賴實(shí)驗(yàn)室的診斷加以確認(rèn)。因此，為了使感染患者及時得到救治，減少DHF的發(fā)病率，建立一種快速、特異的實(shí)驗(yàn)室早期診斷方法顯得尤為重要。而且，進(jìn)一步明確感染病毒的血清型對于流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)理的研究也是非常必要的，有研究已證實(shí)登革病毒感染的血清型與發(fā)病嚴(yán)重程度存在著密切的相關(guān)性，譬如Ⅱ型登革病毒的感染往往引發(fā)較其它3型嚴(yán)重的臨床癥狀。目前，登革病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病毒分離、血清學(xué)檢測和

4、核酸檢測。病毒分離是登革病毒感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，并可進(jìn)一步用于病毒血清型的鑒定，但是該方法費(fèi)時而且對于實(shí)驗(yàn)室的條件要求較高。盡管病毒核酸的檢測方法比傳統(tǒng)的病毒分離法更靈敏快速，但是分子生物學(xué)方法需要特殊的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備和操作技術(shù)，并較易發(fā)生污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果。而血清學(xué)檢測方法不能用于早期診斷，而且由于存在四種血清型登革病毒和其它黃病毒抗原之間的交叉反應(yīng)，結(jié)果易發(fā)生假陽性。此外，對登革病毒的分型診斷也存在問題，目前主要依靠從急性期血樣品中分

5、離病毒，結(jié)合血清型特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光檢測或利用型特異引物進(jìn)行RT-PCR鑒定，這兩者在操作上均無法達(dá)到快速簡便和大量篩查的要求。因此，亟需建立一種更為簡便特異的登革病毒感染早期診斷及分型診斷方法。 登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的主要成員，是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長約11kb，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M、E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,NS5)，其中

6、NS1是研究比較深入的非結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白以膜型和分泌型兩種形式存在，具有群特異性和型特異性決定簇，但對NS1的功能尚未完全清楚，有研究發(fā)現(xiàn)在登革熱患者的早期血中存在高濃度的NS1循環(huán)抗原，而檢測NS1-IgG可初步進(jìn)行登革病毒的分型，因此，我們推測NS1可望成為登革病毒感染的早期診斷及病毒分型診斷靶標(biāo)。本研究結(jié)合我國廣東地區(qū)近年主要以Ⅰ型登革病毒流行的特點(diǎn)，選擇了Ⅰ型登革病毒NS1蛋白(DV1NS1)為研究的靶抗原，通過對NS1基因的克

7、隆、蛋白表達(dá)及其抗原性鑒定，并通過制備一組特異性抗Ⅰ型登革病毒NS1蛋白的單克隆抗體，建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的雙抗體夾心捕獲DV1NS1抗原的酶聯(lián)免疫學(xué)方法，探討NS1在登革病毒感染早期診斷及分型診斷中的作用和意義。 本研究主要分為四個部分： 第一部分：Ⅰ型登革病毒NS1基因克隆及抗原性鑒定 用RT-PCR方法擴(kuò)增Ⅰ型登革病毒NS1全長基因，并定向克隆至原核表達(dá)載體pQE30中，pQE30為攜帶6個組氨酸(His

8、-6)標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)載體，通過對表達(dá)條件和純化條件的優(yōu)化，經(jīng)Ni-NTA親和層析成功純化獲得融合蛋白，命名為DV1NS1。表達(dá)蛋白經(jīng)WesternBlot和ELISA鑒定，證明了可與登革熱患者血清和兔免疫血清特異結(jié)合，具有良好的抗原性，為進(jìn)一步研究免疫診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。 第二部分：Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體的制備及鑒定 本部分研究在成功獲得具有抗原性的DV1NS1蛋白的基礎(chǔ)上，制備抗Ⅰ型登革病毒NS1蛋

9、白特異性單抗，并對單抗進(jìn)行免疫學(xué)特性研究、抗體識別抗原位點(diǎn)分析以及血清型特異性鑒定。采用三種免疫方案免疫BALB/c小鼠，分別為DV1病毒全程免疫、DV1NS1蛋白全程免疫和兩者的混合交替免疫，取抗體效價高的小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，對陽性的克隆細(xì)胞株進(jìn)行有限稀釋法亞克隆化，經(jīng)分別以NS1蛋白和DV1病毒為抗原的兩種間接ELISA篩選，結(jié)合免疫熒光鑒定，最終獲得了10株穩(wěn)定分泌抗NS1蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。10株單抗I

10、g亞類測定，9株為IgG1，1株為IgG2a。抗體親和常數(shù)介于10-6～10-100M。WesternBlot和IFA鑒定除1株單抗與所有4型登革病毒交叉反應(yīng)外，其余的9株特異結(jié)合Ⅰ型登革病毒NS1，與其余3型登革病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，為血清型特異性單抗。采用相互競爭抑制試驗(yàn)分析單抗識別抗原表位，結(jié)果顯示10株單克隆抗體識別6個以上不完全相同的抗原位點(diǎn)，并均能和天然病毒抗原結(jié)合，為下一步建立雙抗體夾心抗原檢測方法奠定了基礎(chǔ)。 第三

11、部分：Ⅰ型登革病毒NS1抗原檢測方法的建立 根據(jù)單抗識別抗原位點(diǎn)、抗體親和力以及抗體效價測定結(jié)果，進(jìn)行組合配對以篩選出最佳的抗體組合。用酶標(biāo)記每一株單抗，將每一株單抗作為捕獲抗體分別與其它株酶標(biāo)記單抗作為檢測抗體進(jìn)行相互配對試驗(yàn)，通過檢測登革病毒培養(yǎng)上清及檢測NS1蛋白的靈敏性和特異性，結(jié)合檢測正常人血的本底值高低，經(jīng)反復(fù)多次篩選，最終確定了以單克隆抗體1F31A5和HRP-5I41A3組合用于構(gòu)建檢測方法。建立的雙抗體夾心抗原

12、捕獲法檢測重組NS1蛋白的靈敏度為5ng/mL，其線性檢測范圍為100～2000ng/mL。進(jìn)一步檢測不同血清型的登革病毒毒株和其它黃病毒的病毒培養(yǎng)液，結(jié)果顯示，采用血清型特異性單抗建立的雙抗體夾心抗原捕獲法僅特異的檢測到Ⅰ型登革病毒，而與其它病毒無交叉反應(yīng)，檢測方法具有型特異性。本部分研究表明，采用抗體夾心抗原捕獲法建立的NS1蛋白檢測方法具有高敏感性和特異性，可為登革病毒感染提供一種新的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。 第四部分：Ⅰ型登革病

13、毒NS1抗原捕獲ELISA初步臨床研究 通過對大量臨床血清樣品的檢測，探討所建立方法在登革病毒感染早期診斷中的價值，并進(jìn)一步評價其在血清型分型診斷中的作用。采用建立的方法檢測了469例正常人血清樣品，確立檢測的臨界值。在469例正常血清樣品中，僅有5例為弱陽性，檢測特異性達(dá)99％。對462例2002～2003年廣東地區(qū)Ⅰ型登革病毒流行期間采集的血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明在發(fā)病的早期可以檢測到高水平的NS1循環(huán)抗原，而且直至發(fā)病第

14、18天，仍可以檢測到血清中存在NS1抗原。在發(fā)病后第1～2天、3～5天、6～10天、11～15天和16～20天各階段采集的血清樣品中，NS1蛋白的陽性率分別為52.8％、68.1％、83.8％、50％和20％。對該462例患者血清，同時也進(jìn)行了登革病毒特異性IgM抗體的檢測，發(fā)病后1～2天，IgM的陽性檢出率僅為17.4％，6～10天IgM陽性率上升至75％，隨后可升高至80％并維持至發(fā)病后16～20天。通過分析血清中NS1抗原存在和D

15、V-IgM抗體產(chǎn)生的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在病程的急性期，兩者的檢測規(guī)律一致，但是在此期間NS1抗原保持著較高的陽性檢出率。尤其在發(fā)病的第1～3天，即可檢測到較高水平的NS1抗原存在，表明NS1抗原的檢測適合于登革病毒感染的早期診斷。對17例經(jīng)型特異RT-PCR鑒定為DV1感染的確診血清進(jìn)行檢測，有14例DV1NS1抗原陽性，因此建立的抗原捕獲ELISA檢測靈敏度為82％。 進(jìn)一步應(yīng)用雙抗體夾心抗原捕獲ELISA檢測了20例Ⅱ型登革熱陽性血

16、清及1例Ⅲ型登革熱陽性血清，結(jié)果呈陰性；檢測13例日本腦炎病毒感染陽性血清、56例麻疹病毒感染陽性血清、51例漢坦病毒感染陽性血清和20例鉤端螺旋體感染陽性血清，結(jié)果亦呈陰性，表明建立的方法具有登革病毒血清型特異性而且同其它相關(guān)或無關(guān)病毒無交叉反應(yīng)，具有高度的特異性，為分型診斷和鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。 綜合以上四個部分的研究結(jié)果，本研究的結(jié)論如下： 一、成功獲得具有良好抗原性的Ⅰ型登革病毒NS1重組蛋白，并進(jìn)一步制備了多株

17、具有血清型特異性的Ⅰ型登革病毒NS1單克隆抗體，為免疫診斷試劑研制、NS1蛋白功能的研究、登革病毒感染的發(fā)病機(jī)理及疫苗研制等奠定基礎(chǔ)。 二、率先建立了雙單克隆抗體夾心的NS1抗原捕獲ELISA，能靈敏的檢測到急性期血中的NS1抗原，適用于登革病毒感染的早期診斷；并可進(jìn)一步發(fā)展為病毒抗原定量分析試劑，用于登革病毒感染患者臨床預(yù)后的判斷。 三、率先建立了具有Ⅰ型登革病毒特異性的NS1抗原捕獲ELISA，可特異的檢測Ⅰ型登革病