人脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域基因的真核、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備.pdf

1、研究目的：利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出有生物學(xué)活性的人脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域(globular domain of adiponectin，gAd)蛋白，為研究gAd蛋白在糖尿病、心血管疾病、子癇等疾病中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建gAd基因的原核表達(dá)載體，并經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化gAd后，制備gAd多克隆抗體,為后續(xù)對人血清脂聯(lián)素檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 （1）第一部分：以人基因組為模板，PCR法擴(kuò)增人gAd基因

2、，將gAd基因與質(zhì)粒pFastBacHTB連接，轉(zhuǎn)化含有穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DH10Bac。篩選轉(zhuǎn)座成功的重組穿梭載體Bacmid-gAd，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，經(jīng)SDS-PAGE，免疫印跡法檢測表達(dá)產(chǎn)物。
　　 （2）第二部分：以人基因組為模板，用PCR方法擴(kuò)增人gAd基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-28a(+)-gAd，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE，免疫印跡法

3、檢測并鑒定表達(dá)產(chǎn)物，表達(dá)的目的蛋白用鎳親和層析柱純化后免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。
　　 研究結(jié)果：
　　 （1）利用真核桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)后，重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞形態(tài)變化明顯，SDS-PAGE圖譜，在相對分子質(zhì)量15～25KD之間有一條新生蛋白帶，免疫印跡法證實(shí)能與相應(yīng)的抗His標(biāo)簽抗體結(jié)合。
　　 （2）原核表達(dá)載體PET-28a(+)-gAd構(gòu)建成功，并獲得gAd重組蛋白，免疫印跡證實(shí)能與抗hi

4、s標(biāo)簽檢測抗體結(jié)合，重組蛋白經(jīng)純化后電泳條帶單一，制備的多克隆抗體經(jīng)間接ELISA法測得效價為1：32 000。免疫印跡證實(shí)，抗血清能特異性地識別gAd蛋白和胎盤組織中的脂聯(lián)素。
　　 結(jié)論：
　　 （1）人gAd基因成功在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步研究脂聯(lián)素在糖尿病、心血管等疾病發(fā)病過程中的作用機(jī)制及治療價值奠定了基礎(chǔ)。
　　 （2）成功構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-28a(+)-gAd，并表達(dá)、純化重組蛋白gAd