登革Ⅱ型病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、鑒定及C6-36細(xì)胞中登革病毒受體分子的初步篩選.pdf

1、登革病毒(Dengue virus,DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬,包括4個(gè)血清型,由埃及伊蚊和白紋伊蚊叮咬具有傳染性的脊椎動(dòng)物宿主進(jìn)行傳播,是目前人類(lèi)最重要的蟲(chóng)媒病毒,感染后可引起登革熱(dengue fever,DF)、登革出血熱(dengue haemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合癥(dengue shocksyndrome,OSS)。
　　 據(jù)統(tǒng)計(jì),每年全球有5000萬(wàn)登革病毒感染者,50萬(wàn)登革出血

2、熱患者,特別是在東南亞、西太平洋地區(qū)和美洲。截至目前,尚無(wú)應(yīng)用于臨床的登革病毒疫苗,缺乏有效的抗登革病毒藥物。登革熱已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
　　 登革病毒為單股正鏈RNA病毒,其病毒基因組編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白及其前體M/prM、包膜蛋白E)和七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a/b、NS3、NS4a/b、NS5)。
　　 登革病毒包膜糖蛋白E由約500個(gè)氨基酸殘基組成,是主要的病毒顆粒包膜

3、蛋白,也是介導(dǎo)病毒感染進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)晶學(xué)的研究表明,登革病毒包膜糖蛋白E與其他黃病毒類(lèi)似,分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域(Ⅰ-Ⅲ):位于中心的β桶狀結(jié)構(gòu)的第一結(jié)構(gòu)域、包含決定二聚體形成內(nèi)融合肽的第二結(jié)構(gòu)域和潛在受體結(jié)合區(qū)的免疫球蛋白樣的第三結(jié)構(gòu)域。
　　 包膜糖蛋白E羧基端的第三結(jié)構(gòu)域折疊為免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu),具備與細(xì)胞結(jié)合的功能；第三結(jié)構(gòu)域獨(dú)立于E蛋白其他結(jié)構(gòu)域,垂直伸出病毒表面形成突起,這些結(jié)構(gòu)特征使該結(jié)構(gòu)域可能是病毒

4、與受體結(jié)合的主要部位。第三結(jié)構(gòu)域包含能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性中和抗體的型和亞型抗原表位。因此第三結(jié)構(gòu)域成為研究登革病毒疫苗、病毒與宿主細(xì)胞受體相互作用的重要靶點(diǎn)。
　　 登革病毒的生活周期全部在宿主細(xì)胞內(nèi)完成:病毒與宿主細(xì)胞表面受體分子結(jié)合后經(jīng)介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,在胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完成一系列的復(fù)制、翻譯、裝配和增殖。而病毒與宿主細(xì)胞表面受體分子的結(jié)合是發(fā)生病毒感染的前提條件。作為典型的蚊媒病毒,登革病毒在蚊蟲(chóng)細(xì)胞中的受體研究歷來(lái)受到重視。

5、鑒定登革病毒的媒介蚊蟲(chóng)受體分子,闡明其作用機(jī)制對(duì)阻斷病毒在蚊蟲(chóng)體內(nèi)的繁殖和播散、發(fā)展有效的蚊媒控制策略、研制抗病毒藥物具有重大意義。
　　 目的
　　 1.克隆登革Ⅱ型病毒E蛋白全長(zhǎng)基因片段,構(gòu)建克隆載體pMD18-T—DV2-E質(zhì)粒:
　　 2.克隆E蛋白第三結(jié)構(gòu)域基因片段,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-DV2-EDⅢ和pET-32a(+)-DV2-EDⅢ質(zhì)粒；
　　 3.誘導(dǎo)重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸

6、桿菌中表達(dá)E蛋白第三結(jié)構(gòu)域；
　　 4.純化重組蛋白并免疫家兔制備多克隆抗血清；
　　 5.VOPBA初步篩選C6/36細(xì)胞中登革病毒結(jié)合分子。
　　 方法
　　 1.利用生物信息學(xué)軟件,對(duì)黃病毒屬不同病毒(DENV、JEV、TBEV、WNV、YFV)的E蛋白第三結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,尋找保守區(qū)域,構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)；
　　 2.分析編碼登革Ⅱ型病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域序列的稀有密碼子；
　　 3.乳鼠腦內(nèi)

7、接種登革病毒傳代,RT-PCR從染毒鼠腦Total RNA中擴(kuò)增登革Ⅱ型病毒E蛋白全長(zhǎng)基因片段,連接pMD18-T載體,構(gòu)建pMD18-T—DV2-E質(zhì)粒；
　　 4.以pMD18-T-DV2-E質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增E蛋白第三結(jié)構(gòu)域基因片段,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-DV2-EDⅢ和pET-32a(+)-DV2-EDⅢ質(zhì)粒；
　　 5.將以上構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)

8、表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS—PAGE分析；
　　 6.超聲裂解誘導(dǎo)菌,對(duì)重組蛋白進(jìn)行可溶性分析；
　　 7.從誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度三個(gè)方面對(duì)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行優(yōu)化;
　　 8.分別使用His·Tag單抗和登革病毒單抗進(jìn)行Western blot,鑒定重組表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性；
　　 9.采取Ni—NTA初步純化和切膠電滲二步純化相結(jié)合進(jìn)行重組表達(dá)產(chǎn)物的純化；
　　 10.純化的重組蛋白免疫

9、家兔,制備多克隆抗血清；
　　 11.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定收獲抗血清的效價(jià)；
　　 12.Western blot和IFA分析收獲抗血清的特異性；
　　 13.利用C6/36細(xì)胞繁殖登革病毒,純化病毒并測(cè)定滴度；
　　 14.提取C6/36細(xì)胞總蛋白和膜蛋白；
　　 15.C6/36細(xì)胞蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)膜后與純化的登革病毒孵育,使用登革病毒單克隆抗體檢測(cè)結(jié)合分子。
　　 結(jié)果
　　 1.黃

10、病毒屬不同病毒(DENV、JEV、TBEV、WNV、YFV)E蛋白第三結(jié)構(gòu)域存在保守序列；
　　 2.編碼登革Ⅱ型病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域的序列中存在稀有密碼子；
　　 3.成功克隆登革Ⅱ型病毒E蛋白全長(zhǎng)基因片段并構(gòu)建克隆載體pMD18-T—DV2-E；
　　 4.成功擴(kuò)增E蛋白第三結(jié)構(gòu)域基因片段并構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-DV2-EDⅢ和pET-32a(+)-DV2-EDⅢ；
　　 5.原核表達(dá)

11、載體pET-28a(+)-Dr2-EDⅢ轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后無(wú)目的蛋白表達(dá)；
　　 6.原核表達(dá)載體pET-32a(+)-DV2-EDⅢ轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸埃希菌中以融合蛋白形式可溶地表達(dá)了E蛋白第三結(jié)構(gòu)域；
　　 7.優(yōu)化的重組菌誘導(dǎo)表達(dá)條件為:25℃,1mmol/L IPTG誘導(dǎo)6h;
　　 8.重組蛋白經(jīng)His·Tag單抗和登革病毒單抗的We

12、stern blot分析,顯示具有良好的免疫反應(yīng)性；
　　 9.經(jīng)Ni—NTA初步純化和切膠電滲二步純化后,純化蛋白的純度可達(dá)98.6％；
　　 10.純化蛋白免疫家兔,收獲抗登革病毒E蛋白第三結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體,經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定其效價(jià)為1:12800,Western blot和IFA顯示其具有一定的反應(yīng)特異性；
　　 11.成功在C6/36細(xì)胞中繁殖登革病毒,純化病毒的滴度測(cè)定為4.52×107PFU/m

13、l；
　　 12.初步篩選發(fā)現(xiàn)67kDa的特異性結(jié)合條帶。
　　 結(jié)論
　　 1.黃病毒屬不同病毒(DENV、JEV、TBEV、WNV、YFV)的E蛋白第三結(jié)構(gòu)域存在保守序列；
　　 2.成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pEI-32a(+)-DV2-EDⅢ,在大腸埃希菌中以融合蛋白形式可溶地表達(dá)了E蛋白第三結(jié)構(gòu)域,Western blot顯示重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性；
　　 3.收獲的抗登革病毒E蛋白第三