轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的：
　　 1.建立轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞模型
　　 2.觀察糖尿病家系融合細(xì)胞線粒體外部形態(tài)及初步功能表現(xiàn)
　　 對(duì)象與方法：
　　 1.研究對(duì)象含T10003C突變位點(diǎn)的糖尿病家系病人1例,2名正常對(duì)照(男、女各1例)。
　　 2.細(xì)胞系及培養(yǎng)p0HeLa細(xì)胞由呂斌老師惠贈(zèng)。p0HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基為高糖DMEM,含10％胎牛血清,補(bǔ)加尿嘧啶50μg/ml和丙酮酸鈉100μg/ml。選擇培養(yǎng)基為高糖DM

2、EM,含10％透析的胎牛血清。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃,含5％CO2的孵育箱中,每2～3天換液1次,每周傳代1～2次。
　　 3.通過選擇培養(yǎng)基(不含尿嘧啶和丙酮酸鹽)初步鑒定p0HeLa細(xì)胞。
　　 4.提取細(xì)胞全基因組DNA,普通PCR擴(kuò)增及Real-time PCR(TaqMan法)進(jìn)一步驗(yàn)證p0HeLa細(xì)胞。
　　 5.通過透射電鏡觀察正常HeLa細(xì)胞、p0HeLa細(xì)胞,進(jìn)而觀察兩者之間差異,從細(xì)胞形態(tài)學(xué)直觀鑒定

3、p0HeLa細(xì)胞。
　　 6.以聚乙二醇為促融劑,采用無(wú)線粒體DNA的p0HeLa細(xì)胞與血小板進(jìn)行融合。分離快速生長(zhǎng)的單克隆細(xì)胞。
　　 7.提取細(xì)胞全基因組DNA,PCR擴(kuò)增mtDNA第10003位所在片段,通過PCR擴(kuò)增鑒定融合后細(xì)胞。
　　 8.透射電鏡觀察融合后細(xì)胞線粒體形態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期p0HeLa細(xì)胞,換用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)及死亡情況。培養(yǎng)一周后

4、p0HeLa細(xì)胞明顯腫脹,輪廓增強(qiáng),多數(shù)懸浮死亡。培養(yǎng)2周左右,細(xì)胞雖有部分存活,但較前明顯減少,細(xì)胞之間拉絲明顯,核內(nèi)容物高倍鏡下解體。培養(yǎng)3周左右細(xì)胞聚集成團(tuán),輪廓清晰。培養(yǎng)4周左右,細(xì)胞幾無(wú)殘活。但同時(shí)用含尿嘧啶或丙酮酸鈉培養(yǎng)基,細(xì)胞生長(zhǎng)較好,四至五天須消化傳代。表現(xiàn)出對(duì)尿嘧啶和丙酮酸鹽的依賴性。
　　 2.PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示正常HeLa細(xì)胞及融合細(xì)胞出現(xiàn)940bp的目的條帶,但p0HeLa細(xì)胞無(wú)相應(yīng)條帶。從而初步提示

5、p0HeLa細(xì)胞株為mtDNA缺失的細(xì)胞株,融合細(xì)胞有功能性的mtDNA。Real-time PCR結(jié)果顯示經(jīng)過40個(gè)循環(huán)未檢測(cè)到mtDNA,但正常HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)正常拷貝數(shù)(108)。進(jìn)一步說明此細(xì)胞株已無(wú)mtDNA殘留。
　　 3.透射電鏡結(jié)果示p0HeLa細(xì)胞鏡下線粒體嵴破壞,僅殘留部分,部分甚至缺如。線粒體出現(xiàn)空泡改變,核形態(tài)基本正常。正常hela細(xì)胞線粒體較多,呈圓形或橢圓形,基質(zhì)較致密,嵴清晰。融合后細(xì)胞線粒體部分呈