轉(zhuǎn)kap6.1pcdna3.12s綿羊成纖維細(xì)胞株的建立

1、學(xué)校代碼：1 0 2 2 5學(xué) 號(hào)：S 1 4 5 6 5學(xué)位論文轉(zhuǎn)K a p 6 ．卜p c D N A 3 ．卜2 S 綿羊成纖維細(xì)胞株的建立指導(dǎo)教師姓名：申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：詹俐楠安鐵洙教授碩士2 0 1 4 年4 月東北林業(yè)大學(xué)東北林業(yè)大學(xué)學(xué)科專(zhuān)業(yè)： 發(fā)育生物學(xué)論文答辯日期： 2 0 1 4 年6 月授予學(xué)位日期： 2 0 1 4 年6 月答辯委員會(huì)主席：論文評(píng)閱人：聾夕厶櫛素大學(xué)轉(zhuǎn)K 印6 ．1 - p

2、c D N A 3 ．1 —2 S 綿羊成纖維細(xì)胞株的建立摘要蜘蛛絲具有無(wú)可比擬的優(yōu)良性能，是具有分層結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料。關(guān)于蜘蛛絲蛋白的研究，一直以來(lái)都是科學(xué)研究者們關(guān)注的重點(diǎn)。由于蜘蛛高度的領(lǐng)土意識(shí)及侵略性，使得人工飼養(yǎng)蜘蛛具有一定的困難。本研究利用羊毛中的角蛋白相關(guān)蛋白基因＆叫5 ．1 作為啟動(dòng)子，將其與帶有n e o 抗性的p c D N A 3 ．1 相連接構(gòu)建真核表達(dá)載體，再利用本實(shí)驗(yàn)室前期合成的蜘蛛拖絲蛋白二聚體2 S 與其相

3、連，構(gòu)建可以啟動(dòng)蜘蛛拖絲蛋白的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染綿羊皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)G 馮1 8 篩選出陽(yáng)性細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，建立轉(zhuǎn)蜘蛛拖絲蛋白二聚體的綿羊皮膚成纖維細(xì)胞株，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果與結(jié)論如下：1 、真核表達(dá)載體的構(gòu)建：雙酶酶切去除p c D N A 3 ．1 自身的自啟動(dòng)子C M V ，以同樣的一對(duì)酶對(duì)＆嘶．1 進(jìn)行酶切并與p c D i №夠．1 相連接，再與蜘蛛拖絲蛋白二聚體2 S 相連，成功構(gòu)建真核表達(dá)載體K

4、 a p 6 ．1 ．p c D N A 3 ．1 ．2 S 。2 、綿羊皮膚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選：將＆I p 6 ．1 - p c D N A 3 ．1 - 2 S 線(xiàn)性化后，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染綿羊皮膚成纖維細(xì)胞，使用最適濃度的G 4 1 8 進(jìn)行篩選，獲得具有n e o 抗性的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞。3 、轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)：對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞提取其基因組D N A ，采用P C R方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明線(xiàn)性化K a p 6 ．1 ．p