穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞株的建立與鑒定及其NMR波譜和材料相容性研究.pdf

1、本文旨在建立分離培養(yǎng)和鑒定大鼠骨骺生長板軟骨細(xì)胞亞群的實(shí)驗(yàn)方法，探討其靜止區(qū)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性；并通過基因工程技術(shù)，誘導(dǎo)靜止區(qū)骺軟骨細(xì)胞穩(wěn)定分化，篩選穩(wěn)定分化株，研究其基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，監(jiān)測(cè)細(xì)胞表面的代謝變化和細(xì)胞內(nèi)離子濃度，全面評(píng)估其遺傳特征保存情況；分析穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞與納米組織工程材料的復(fù)合黏附特性及其增殖分化的變化。本課題深入研究骨骺軟骨細(xì)胞增殖、分化規(guī)律，為人工調(diào)控骨與軟骨的生長和通過現(xiàn)代組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨的研究建立實(shí)

2、驗(yàn)基礎(chǔ)。 通過顯微外科技術(shù)解剖大鼠長骨骨骺生長板軟骨，酶消化法獲得分散的單細(xì)胞懸液；采用percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離生長板細(xì)胞亞群，分層培養(yǎng)、觀察不同層細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)分析，電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)不同細(xì)胞FGFR-3、X和Ⅱ型膠原的表達(dá)。利用獲得的骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞亞群，提取總RNA，RT-PCR方法獲得PTHrp基因的全長cDNA，擴(kuò)增后經(jīng)純化、雙酶切連接到真核

3、表達(dá)載體pEGFP-IRES2；轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒pEGFP-IRES2-PTHrp，進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有PTHrp基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的新生大鼠軟骨前體細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，抗性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)傳代。應(yīng)用FGFR-3、Ⅱ型膠原、X型膠原和PTHrp抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，檢測(cè)其表型及分化能力，觀察細(xì)胞的形態(tài)及其生長狀況，繪制細(xì)胞生長曲線。用RT-PCR、Southernblot和west

4、emblot從不同層次鑒定PTHrp基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。以重水(D2O)緩沖液重懸傳代培養(yǎng)的穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞，在灌流條件下，利用inova600型液態(tài)核磁共振譜儀測(cè)定細(xì)胞的31P-NMR波譜，和細(xì)胞內(nèi)游離Mg2+濃度，觀察波譜組成及各波峰高度，評(píng)價(jià)細(xì)胞代謝情況。嘗試細(xì)胞與nanoHA/PDLLA多孔材料復(fù)合培養(yǎng)7天后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和掃描電鏡觀察及MTT測(cè)定，了解細(xì)胞增殖及黏附情況，獲得了穩(wěn)定分化骨骺干細(xì)胞與組織工程材料的相容性

5、、黏附性的初步資料。 我們獲得了四層生長板軟骨細(xì)胞亞群，細(xì)胞活性達(dá)到了95％以上；原代培養(yǎng)細(xì)胞呈多角形，第8代細(xì)胞仍保持多角的形態(tài)；前4代細(xì)胞的每日倍增指數(shù)隨著傳代次數(shù)的增加而增加，第8代后顯著降低。依照細(xì)胞成熟程度，體積逐漸增大，密度逐層減小；軟骨前體細(xì)胞表面有FGFR-3的表達(dá)，其他層細(xì)胞均為陰性；隨著細(xì)胞的逐漸成熟，Ⅱ型膠原表達(dá)逐漸減弱，而X型膠原的表達(dá)逐漸增強(qiáng)；隨著傳代次數(shù)增加陽性細(xì)胞的比例下降。從增殖區(qū)細(xì)胞提取的總RN

6、A純度、含量均符合要求，RT-PCR和PCR產(chǎn)物電泳可在預(yù)期大小處得到清晰條帶，酶切、連接、轉(zhuǎn)化后獲得2株陽性轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大提產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析可得到目的基因條帶和載體條帶，DNA序列測(cè)定證實(shí)目的基因已插入重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入軟骨前體細(xì)胞后獲得1個(gè)陽性細(xì)胞克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)為具有較強(qiáng)增值能力和多分化潛能。經(jīng)Southem印跡雜交和Western證實(shí)，PTHrp已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入軟骨前體細(xì)胞，表達(dá)其mRNA及其蛋白。轉(zhuǎn)染

7、細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，命名為穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞(immortalizedprecartilaginousstemcell，IPSC)。貼壁培養(yǎng)的IPSC，群體倍增時(shí)間為22.92h，傳代、凍存和復(fù)蘇對(duì)細(xì)胞形態(tài)及生長無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)成功獲得穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞株31p-NMR波譜，發(fā)現(xiàn)其由PCr、ATP、Pi等五個(gè)共振峰組成，細(xì)胞內(nèi)游離Mg2+濃度為0.326mmol/L。穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞與nanoHA/PDLLA多孔材料具有良好的相容

8、性，細(xì)胞在材料上生長良好，材料對(duì)細(xì)胞增殖無不良影響，為進(jìn)一步應(yīng)用研究研究打下基礎(chǔ)。 通過上述研究，我們發(fā)現(xiàn)能夠通過密度梯度離心法分離骨骺生長板細(xì)胞亞群，并可以獲得四個(gè)高純度、高活性的軟骨細(xì)胞亞群。第4代以前細(xì)胞表型穩(wěn)定，可以作為研究軟骨增殖分化調(diào)控的細(xì)胞平臺(tái)。從骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞亞群中克隆PTHrp基因構(gòu)建其真核表達(dá)載體，可誘導(dǎo)軟骨前體細(xì)胞穩(wěn)定分化。穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞的31P-NMR波譜形態(tài)正常，代謝正常，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；細(xì)

9、胞與nanoHA/PDLLA多孔材料相容性良好，黏附能力強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)所獲得的穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞株為骺軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究及其介導(dǎo)的細(xì)胞移植治療提供了穩(wěn)定的細(xì)胞來源。為進(jìn)一步揭示PTHrp的生物學(xué)功能及其在在軟骨細(xì)胞的分化和骨骼形態(tài)發(fā)生中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)，可望成為一種新的治療手段。 第一章骨骺細(xì)胞亞群的分離鑒定和生物學(xué)性狀研究 目的：分離培養(yǎng)并鑒定大鼠骨骺生長板軟骨細(xì)胞亞群，探討各亞群生物學(xué)特性，為研究軟骨細(xì)胞增殖分化

10、的調(diào)控和軟骨組織工程修復(fù)的研究建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：顯微解剖大鼠長骨骨骺生長板軟骨，酶消化法獲得分散的單細(xì)胞懸液。采用percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離生長板細(xì)胞亞群，分層培養(yǎng)、觀察不同層細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)分析，電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)不同細(xì)胞FGFR-3、X和Ⅱ型膠原的表達(dá)。結(jié)果：我們獲得了四層生長板軟骨細(xì)胞亞群，細(xì)胞活性達(dá)到了95％以上；原代培養(yǎng)細(xì)胞呈多角形，第8代細(xì)胞仍保持多角的形態(tài)

11、；前4代細(xì)胞的每日倍增指數(shù)隨著傳代次數(shù)的增加而增加，第8代后顯著降低。依照細(xì)胞成熟程度，體積逐漸增大，密度逐層減??；前體細(xì)胞表面有FGFR-3的表達(dá)，其他層細(xì)胞為陰性；隨著細(xì)胞的逐漸成熟，Ⅱ型膠原表達(dá)逐漸減弱，而X型膠原的表達(dá)逐漸增強(qiáng)；隨著傳代次數(shù)增加陽性細(xì)胞的比例下降。結(jié)論：骨骺生長板存在四個(gè)不同細(xì)胞亞群，并能夠通過密度梯度離心法分離，可以獲得高純度、高活性的軟骨細(xì)胞亞群。第4代前的細(xì)胞表型穩(wěn)定，可以作為研究軟骨增殖分化調(diào)控的細(xì)胞平臺(tái)

12、。 第二章PTHrp基因的克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建 目的：從大鼠骨骺生長板軟骨細(xì)胞增殖區(qū)亞群中克隆PTHrp基因并構(gòu)建其真核表達(dá)載體pEGFP-IRES2-PTHrp。方法：Percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離大鼠骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，提取總RNA，用RT-PCR方法獲得PTHrp基因的全長cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物回收純化、雙酶切后連接到真核表達(dá)載體pEGFP-IRES2；轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒pEGFP-IR

13、ES2-PTHrp，進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定。結(jié)果：總RNA純度、含量均符合要求；PCR產(chǎn)物電泳可在預(yù)期大小處得到清晰條帶，連接轉(zhuǎn)化后獲得2株陽性轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大提產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析可得到目的基因條帶和載體條帶，DNA序列測(cè)定證實(shí)目的基因已插入重組質(zhì)粒。結(jié)論：準(zhǔn)確從骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞中克隆了PTHrp基因成功構(gòu)建其真核表達(dá)載體pEGFP-IRES2-PTHrp，為進(jìn)一步揭示PTHrp的生物學(xué)功能及其在在軟骨細(xì)胞的分化和骨

14、骼形態(tài)發(fā)生中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。 第三章穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞株的建立及鑒定 目的：建立穩(wěn)定分化大鼠骨骺軟骨前體細(xì)胞株，為細(xì)胞移植治療和轉(zhuǎn)基因治療提供穩(wěn)定的細(xì)胞來源。方法：利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有甲狀旁腺激素相關(guān)肽(parathroidhormone-relatedpeptide，PTHrp)基因的重組質(zhì)粒pEGFP-IRES2-PTHrp轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的新生大鼠軟骨前體細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，抗性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)

15、傳代。應(yīng)用FGFR-3、Ⅱ型膠原、X型膠原和PTHrp抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，檢測(cè)其表型及分化能力，觀察細(xì)胞的形態(tài)及其生長狀況，繪制細(xì)胞生長曲線。用RT-PCR、Southernblot和westernblot從不同層次鑒定PTHrp基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后獲得1個(gè)陽性細(xì)胞克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)為具有較強(qiáng)增值能力和多分化潛能的軟骨前體細(xì)胞。經(jīng)Southern印跡雜交和Western證實(shí)，PTHrp已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入軟骨前體細(xì)胞，

16、表達(dá)其mRNA及其蛋白。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，命名為穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞(immortalizedprecartilaginousstemcell，IPSC)。貼壁培養(yǎng)的IPSC，群體倍增時(shí)間為23.52h，傳代、凍存和復(fù)蘇對(duì)細(xì)胞形態(tài)及生長無明顯影響。結(jié)論：PTHrp基因?qū)肟烧T導(dǎo)軟骨前體細(xì)胞穩(wěn)定分化，為骨骺軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究及其介導(dǎo)的細(xì)胞移植治療提供了穩(wěn)定的細(xì)胞來源。 第四章穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞株的NMR波譜及其與納米組織工程材

17、料相容性研究 目的：研究穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞株細(xì)胞代謝情況和測(cè)定細(xì)胞內(nèi)離子濃度；觀察細(xì)胞株與的納米組織工程材料相容性，以及材料對(duì)細(xì)胞增殖、分化的作用的影響。方法：以重水(D2O)緩沖液重懸傳代培養(yǎng)的穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞，在灌流條件下，利用inova600型液態(tài)核磁共振譜儀測(cè)定細(xì)胞的31p-NMR波譜，和細(xì)胞內(nèi)游離Mg2+濃度，觀察波譜組成及各波峰高度，評(píng)價(jià)細(xì)胞代謝情況。細(xì)胞與nanoHA/PDLLA多孔材料復(fù)合培養(yǎng)7天后，進(jìn)行形

18、態(tài)學(xué)觀察和掃描電鏡觀察及MTT測(cè)定，了解細(xì)胞增殖及黏附情況。結(jié)果：成功獲得穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞株31P-NMR波譜，由PCr、ATP、Pi等五個(gè)共振峰組成，細(xì)胞內(nèi)游離Mg2+濃度為0.326mmol/L，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞與nanoHA/PDLLA多孔材料具有良好的相容性，細(xì)胞在材料上生長良好，材料對(duì)細(xì)胞增殖無不良影響。結(jié)論：穩(wěn)定分化軟骨前體細(xì)胞的31p-NMR波譜形態(tài)正常，代謝穩(wěn)定；細(xì)胞與nanoHA/PDLL