丙型肝炎病毒F蛋白抗原性、抗凋亡作用及細(xì)胞內(nèi)磷酸化研究.pdf

1、本文對(duì)丙型肝炎病毒F蛋白抗原性、抗凋亡作用及細(xì)胞內(nèi)磷酸化進(jìn)行了研究。主要內(nèi)容如下： 一、根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性原則設(shè)計(jì)了11條引物，應(yīng)用引物延伸法合成了HCV f基因，以此為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到截短型f65基因片段(219bp)。將f65基因片段定向克隆至pET32a(+)，得到pET32a-f65重組子，然后將重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌Plyss菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得分子量約32kDa的HCV F65蛋白。 二、應(yīng)用35

2、0μg/ml G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)F蛋白的HepG2細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1<'+>的HepG2細(xì)胞(Hep-3.1)為對(duì)照。WB檢測(cè)顯示，第1代和第10代Hep-f細(xì)胞均能表達(dá)14kDa左右的F蛋白。應(yīng)用MTT法分別測(cè)定Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示Hep-3.1細(xì)胞生長(zhǎng)速度落后于Hep-f細(xì)胞生長(zhǎng)速度(p<0.01)，說明HCV f基因促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖。分別采用20、40、60、100和200U

3、/ml TNF-α處理Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞，然后應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明，20～200U/ml TNF-α對(duì)Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為4.8～19.4％和8.3～53.1％，前者低于后者(p<0.05)，提示Hep-f細(xì)胞對(duì)TNF-α具有一定的抵抗作用。 三、應(yīng)用引物延伸法獲得突變型HCV f基因，該基因第13、14、114、121和124位密碼子由野生型f基因的TCT突變?yōu)镚AT，