丙型肝炎患者抗—F流行率及F蛋白對細(xì)胞（抑）癌基因的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬(Flaviviridaehepacivirus)，為顆粒狀單正鏈RNA病毒。HCVHCV可以導(dǎo)致急性、慢性肝炎和肝纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)。HCV基因組全長約9600個核苷酸，結(jié)構(gòu)為：5’非編碼區(qū)(5’UTR)-結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白C-包膜蛋白E1、E2)-非結(jié)構(gòu)蛋白(P7-NS2-

2、NS3-NS4-NS5)-3’非編碼區(qū)(3’UTR)。HCV基因組僅含有一個開放讀碼框(openreadingframe，ORF)，編碼大約3010個氨基酸的多蛋白前體，前體蛋白在翻譯同時或翻譯后被宿主細(xì)胞及病毒自身編碼的蛋白酶水解為C～NS5b的10種結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。HCVF蛋白是C基因+1移位后所形成新讀框(alternativereadingframe，ARF，C基因密碼子第2位堿基為新讀框密碼子第1位堿基)編碼的基因產(chǎn)物，作為

3、新近鑒定出的HCV基因組編碼產(chǎn)物，目前對F蛋白的生物學(xué)性狀研究尚處在起步階段。本研究利用大腸桿菌表達(dá)的重組HCVF蛋白為捕獲抗原，ELISA檢測HCV感染者血清中抗體情況，了解F蛋白是否可以在感染者體內(nèi)天然表達(dá)。結(jié)合HCV感染者臨床資料，初步評價F蛋白與丙型肝炎的疾病相關(guān)性，以及在HCV感染的實(shí)驗(yàn)室檢測及誘導(dǎo)保護(hù)性中和抗體中的作用。另一方面，利用Westernblot和實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測表達(dá)F蛋白的HepG2細(xì)胞中3種(抑)癌基因變

4、化，借以判斷F蛋白在HCV相關(guān)的HCC發(fā)生中的作用。 一、丙型肝炎患者中抗-F的血清抗體流行率以HCV1b亞型序列為模板，擴(kuò)增氨基端部分缺失的HCVF基因讀框(codon75～codon134)至原核表達(dá)載體pET32a，含F(xiàn)基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)產(chǎn)物用Ni-NTA樹脂純化。以純化蛋白作為捕獲抗原，包被酶標(biāo)平板，間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EIA)檢測35份HCV感染者、8份非HCV感染肝病患者及10份健康人血清標(biāo)本。以健康者血清

5、OD450nm均值+0.1作為陽性判定值，分析HCV感染者血清抗-F陽性率，結(jié)合患者臨床資料，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析F蛋白與HCV感染的疾病指標(biāo)相關(guān)性。結(jié)果顯示，在35份HCV感染者血清標(biāo)本中，抗-F的陽性率為43％(15/35)，對照組(8份非HCV肝病患者及10份健康人)血清中抗-F無一例陽性，兩組之間OD450nm均值和抗-F陽性率都存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.005，說明F蛋白可以在HCV感染者體內(nèi)天然地表達(dá)，并誘生特異性體液免疫反應(yīng)?？?/p>

6、方檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)抗-F與HCV感染者年齡、性別、病程及血清HCVRNA載量之間存在相關(guān)性。其中，抗-F在四種HCV感染病程中的檢出率分別為：急性50％(3/6)、慢性輕度50％(7/14)、慢性中度27％(3/11)、慢性重度50％(2/4)(慢性中度組與其它三組比較無差異，p＞0.1)?？?F在HCV感染急性期和慢性期有穩(wěn)定的檢出率(50％和41％)說明HCVF蛋白在HCV感染者體內(nèi)變異小，能夠穩(wěn)定誘導(dǎo)宿主體液免疫反應(yīng)，具備作為實(shí)驗(yàn)室診斷

7、HCV感染的候補(bǔ)抗原價值?？?F與HCV感染病程無關(guān)，提示其造成免疫損傷的可能性較小，HCVF蛋白具有作為保護(hù)性疫苗的深入研究意義。 二、F蛋白對細(xì)胞內(nèi)c-myc、p21和p53表達(dá)的影響以pGEM-HCJ4質(zhì)粒(含全長1b亞型HCV基因組)為模板，設(shè)計(jì)合適引物，PCR擴(kuò)增完整讀框HCVF基因和C基因，選擇合適酶切位點(diǎn)分別克隆至pcDNA3.1+真核表達(dá)載體。此外，構(gòu)建含CF融合基因的表達(dá)載體。含HCVF基因質(zhì)粒單獨(dú)或以不同比例

8、(10∶1，1∶1，1∶10)與含C基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，24h～48h瞬時檢測兩蛋白表達(dá)。以重組HCVF抗原免疫家兔血清作為抗F蛋白-抗，HCV感染者混合血清(ELISA試劑盒證實(shí)抗HCV陽性)作為抗C蛋白-抗，Westernblot證實(shí)HCVF蛋白和C蛋白在HepG2細(xì)胞內(nèi)瞬時表達(dá)。轉(zhuǎn)染48h，Westernblot或qPCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞癌基因c-myc和抑癌基因p21、p53表達(dá)，相對于空載體(目標(biāo)基因表達(dá)量標(biāo)定為100

9、％)，HCVF蛋白分別升高了HepG2細(xì)胞c-myc和p21表達(dá)量3.8倍和41％(表達(dá)量分別為480％和141％，以下依此類推)，降低了p53表達(dá)67％，C蛋白升高c-myc和p21表達(dá)量60％和21％，降低了p53表達(dá)59％。qPCR檢測p21、p53表達(dá)結(jié)果與Westernblot結(jié)果一致，說明F蛋白調(diào)節(jié)三基因表達(dá)發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平上。HCVF蛋白影響(抑)癌基因表達(dá)幅度與C蛋白存在差別，但調(diào)節(jié)趨勢一致。HCVF基因質(zhì)粒與C基因質(zhì)

10、粒按照10∶1、1∶1、1∶10比例共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，相對于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞目標(biāo)基因表達(dá)量100％而言，c-myc表達(dá)量分別為1.7、5.5、1.8，p21表達(dá)量分別為1.18、1.24、1.25，p53表達(dá)量分別為0.87、0.72、0.44；HCVCF融合基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的c-myc、p21和p53表達(dá)量分別為2.1、1.29和0.68。HCVF蛋白與C蛋白共表達(dá)對三種基因轉(zhuǎn)錄無加強(qiáng)或者減弱的情況，提示在影響(抑)癌基因上，不存在

11、F蛋白與C蛋白相互作用的證據(jù)。HCVF蛋白影響細(xì)胞(抑)癌基因表達(dá)是個復(fù)雜的雙向調(diào)節(jié)過程，它既可以通過增加癌基因c-myc轉(zhuǎn)錄水平和降低抑癌基因p53轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)感染細(xì)胞轉(zhuǎn)化，也能通過增加抑癌基因p21的轉(zhuǎn)錄來抑制宿主細(xì)胞惡變。 三、小結(jié)1、以重組HCVF蛋白為捕獲抗原，EIA檢測各期HCV感染者血清中抗-F陽性率為43％(15/35)，8份非HCV感染的肝病患者和10份健康人血清無一例陽性，證明F蛋白作為新被證實(shí)的HCV基因組編

12、碼產(chǎn)物，可以特異性地在HCV感染者體內(nèi)天然表達(dá)和誘生特異性的體液免疫反應(yīng)。抗-F在HCV感染各個病程中檢出率穩(wěn)定在40％～50％，顯示出體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的F蛋白具有作為HCV實(shí)驗(yàn)室診斷的候補(bǔ)抗原價值?？?F與HCV感染的疾病輕重程度無關(guān)，其具有的免疫損傷可能性較小，如能進(jìn)一步證實(shí)抗-F具有中和保護(hù)作用，則HCVF蛋白將具有作為誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的疫苗價值。 2、借助pcDNA3.1+真核表達(dá)系統(tǒng)，HCVF蛋白可以單獨(dú)或以不同比例與C蛋白

13、在HepG2細(xì)胞內(nèi)瞬時(48h)表達(dá)，對c-mye、p21和p53mRNA和蛋白水平的qPCR及Westernblot檢測顯示，同C蛋白一樣，F(xiàn)蛋白升高c-myc、p21表達(dá)，降低p53表達(dá)。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)未能證明在影響(抑)癌基因轉(zhuǎn)錄上F蛋白與C蛋白存在相互作用。HCVF蛋白影響HCC發(fā)生存在雙向性，它一方面通過升高癌基因c-myc和降低抑癌基因p53的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，另一方面，它通過上調(diào)抑癌基因p21的表達(dá)減低前者的誘導(dǎo)癌變作用。