CpG基序甲基化狀態(tài)及其調(diào)控因素在SLE發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、第一部分SLE患者與正常人CpG基序甲基化狀態(tài)與DNMT的表達
　　目的：研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(SLE)CpG基序甲基化狀態(tài)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的mRNA表達水平,并探討兩者的關(guān)系。
　　方法：分離38例SLE患者與19例正常人外周血淋巴細(xì)胞,分別用5-甲基胞嘧啶抗體與流式細(xì)胞儀檢測CpG基序甲基化水平和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的mRNA表達水平。
　　

2、結(jié)果：活動期SLE患者的CpG基序甲基化水平(8.08±1.70)低于正常對照組(11.61±1.20,P<0.01)與緩解期SLE患者(10.97±1.46,P<0.05),正常人與緩解期SLE患者的CpG基序甲基化水平相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。SLE患者的CpG基序甲基化水平與SLE-DAI成負(fù)相關(guān)(r=-0.79,P<0.05)。活動期SLE患者(0.4214±0.178)與緩解期SLE患者(0.5164±0.162

3、)的DNMT1表達水平均低于正常對照組(0.7814±0.192,P<0.05)?；顒悠凇⒕徑馄赟LE患者DNMT1的表達水平相比,無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。活動期(0.6984±0.183)、緩解期(0.760±0.175)SLE患者及正常人(0.724±0.158)的DNMT3A表達水平相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DNMT3B的表達水平極低。活動期與緩解期SLE患者DNMT1的表達水平與SLE-DAI的相關(guān)性不明

4、顯(r=-0.23,P>0.05)。SLE患者CpG基序甲基化水平與DNMT1的表達水平相關(guān)性不明顯(r=0.28,P>0.05)。
　　結(jié)論：SLE患者CpG基序甲基化水平的下降在SLE發(fā)病機制中具有重要作用。DNMT1表達水平的下降在SLE發(fā)病機制中可能起重要作用,但不是決定SLE患者CpG基序甲基化狀態(tài)的惟一因素。
　　第二部分內(nèi)外因素對CpG基序甲基化狀態(tài)與DNMT1表達的影響
　　目的：探討5-氮雜胞苷、雌二

5、醇及紫外線(254nm)對SLE患者與正常人CpG基序甲基化狀態(tài)與DNMT1表達的影響。
　　方法：分離12例SLE患者與11例正常人外周血淋巴細(xì)胞,經(jīng)PHA刺激1天后,分為未處理組、5-氮雜胞苷組、雌二醇組、紫外線組,繼續(xù)培養(yǎng)3天后分別用5-甲基胞嘧啶抗體與流式細(xì)胞儀檢測CpG基序甲基化水平和實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(realtimeRT-PCR)分析DNMT1的mRNA表達水平。
　　結(jié)果：與非處理組相比,5-氮雜胞

6、苷組SLE患者與正常人的CpG基序甲基化水平均下降(p<0.1),DNMT1表達水平的下降無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05);雌二醇組、紫外線組SLE患者與正常人的CpG基序甲基化水平與DNMT1的mRNA表達水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。 結(jié)論：5-氮雜胞苷可抑制CpG基序甲基化狀態(tài),其抑制作用的產(chǎn)生與DNMT1表達水平的下降無明顯相關(guān)性。雌二醇與紫外線(254nm)對CpG基序甲基化狀態(tài)與DNMT1的表達水平的影響無統(tǒng)

7、計學(xué)意義。
　　第三部分甲基CpG結(jié)合域蛋白的構(gòu)建、表達、鑒定
　　目的：在大腸桿菌中表達甲基CpG結(jié)合域四聚體蛋白,并對其進行純化和鑒定。
　　方法：將重組表達質(zhì)粒4×MBD-pETI30b+轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a克隆擴增并測序鑒定后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后接種于LB培養(yǎng)基中,異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白的表達,表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和純化,通過SDS-PAGE和Westemblotting鑒