miR-26a在子宮平滑肌瘤發(fā)病中的作用及其啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)CpG二核苷酸甲基化狀態(tài)研究.pdf

1、研究背景與目的:子宮肌瘤是女性生殖器最常見(jiàn)的良性腫瘤，多見(jiàn)于30-50歲的婦女，發(fā)病率占20-30％，有報(bào)道40-50歲婦女子宮肌瘤發(fā)病率高達(dá)51.2％-60％。其主要癥狀包括異常子宮出血、盆腔受壓引起下腹部不適、肌瘤變性或扭轉(zhuǎn)引起疼痛等，嚴(yán)重時(shí)甚至可致流產(chǎn)或不孕等，嚴(yán)重威脅廣大女性的身心健康。子宮肌瘤雖為良性腫瘤，但也有少數(shù)可發(fā)生惡變(0.13％～1.39％)，加之其居高不下的發(fā)病率，年輕化的發(fā)病趨勢(shì)，對(duì)整個(gè)醫(yī)療體系及社會(huì)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展造

2、成了很大的影響。目前對(duì)于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，若能對(duì)發(fā)病機(jī)理有新的認(rèn)識(shí)可為其治療提供新的思路。
　　 目前普遍認(rèn)為子宮肌瘤是雌、孕激素依賴(lài)性的良性腫瘤，藥物治療主要通過(guò)拮抗雌、孕激素及其受體的表達(dá)。在課題組前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在子宮肌瘤中miR-26a顯著低表達(dá)的(P＜0.05)，對(duì)ERα、PRa起調(diào)控作用，所以我們猜測(cè)是否miR-26a在子宮肌瘤中對(duì)ERα、PRa的調(diào)節(jié)失控，促使ERα、PRa的表達(dá)增加，從而增加子宮平滑肌瘤細(xì)胞

3、對(duì)雌、孕激素的敏感性增加而促進(jìn)肌瘤的生長(zhǎng)？再者miR-26a在子宮肌瘤中低表達(dá)是否是因?yàn)槠渖嫌蔚膯?dòng)子調(diào)控區(qū)CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化而引起的？基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果、miR-26a研究現(xiàn)狀及立題思路，我們?cè)噲D通過(guò)研究miR-26a的表達(dá)對(duì)雌、孕激素生物學(xué)效應(yīng)的影響，探討miR-26a在子宮平滑肌瘤發(fā)病中的作用，以及通過(guò)對(duì)miR-26a上游啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化分析進(jìn)一步深入探討子宮平滑肌瘤的發(fā)病機(jī)制，以期能為子宮平滑肌瘤的的靶向治療提供新

4、的思路。
　　 研究方法:我們通過(guò)Ⅰ型膠原酶消化、篩網(wǎng)過(guò)濾分離法成功分離培養(yǎng)了子宮平滑肌瘤細(xì)胞，并對(duì)所獲得的細(xì)胞根據(jù)化學(xué)免疫進(jìn)行純度鑒定。
　　 原代培養(yǎng)的細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-26a的mimic及miR-26a的inhibitor分別使其高表達(dá)和低表達(dá)，或加入雌、孕激素受體拮抗劑，從而得基礎(chǔ)分組（Blank組、NC mimic組、miR-26amimic組、miR-26a inhibitor組、ERα拮抗劑組、P

5、Ra拮抗劑組），之后每組分別加入雌激素或孕激素，培養(yǎng)48h后進(jìn)行CCK-8增殖檢測(cè)，檢測(cè)雌、孕激素與其受體抑制的增殖作用以及miR-26a高、低表達(dá)時(shí)加入雌、孕激素后的增殖作用，從而驗(yàn)證miR-26a在子宮平滑肌瘤細(xì)胞中對(duì)雌、孕激素敏感性的影響，以從細(xì)胞水平上進(jìn)一步探討miR-26a在子宮肌瘤中的作用。
　　 用軟件分析miR-26a上游的的啟動(dòng)子452堿基序列，發(fā)現(xiàn)該序列中有潛在4個(gè)甲基化位點(diǎn)（30位點(diǎn)、99位點(diǎn)、283位點(diǎn)、

6、406位點(diǎn)），用BSP測(cè)序法（即結(jié)合重亞硫酸鹽測(cè)序法）檢測(cè)miR-26a基因啟動(dòng)子4個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化頻率。首先通過(guò)收集子宮肌瘤組織及瘤旁的正常肌層組織6例，進(jìn)行基因組DNA的提取，用重亞硫酸鹽處理基因組DNA，修飾后純化與回收，對(duì)修飾后的CpG進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，每個(gè)組織對(duì)應(yīng)的DNA選取10個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，并與參考序列進(jìn)行對(duì)比，即可確定所研究的CpG位點(diǎn)的甲基化頻率，共12個(gè)組織，挑取120個(gè)克隆，測(cè)序1

7、20個(gè)反應(yīng)，從而確定了4個(gè)位點(diǎn)的CpG甲基化頻率。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過(guò)Ⅰ型膠原酶消化法成功培養(yǎng)子宮平滑肌瘤細(xì)胞，其成功率達(dá)89％。并根據(jù)細(xì)胞的化學(xué)免疫方法檢測(cè)出所獲得的子宮平滑肌瘤細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定，得到細(xì)胞的純度在96％以上。
　　 我們將帶羧基熒光素的NC mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率在75％以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a mimic組增殖速度顯著慢于對(duì)照組(P＜0.05)，抑制細(xì)

8、胞增殖，且其抑制作用與單獨(dú)加入雌激素受體拮抗劑或孕激素受體拮抗劑相當(dāng)，加入雌激素、孕激素后，miR-26a mimic組抑制增殖作用未明顯增強(qiáng);而轉(zhuǎn)染miR-26ainhibitor組與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖快(P＜0.05)，再加入雌、孕激素后其增殖作用較前明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，說(shuō)明低表達(dá)miR-26a可以增強(qiáng)子宮平滑肌瘤細(xì)胞對(duì)雌、孕激素的敏感性，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　 BSP克隆測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果顯示，重亞硫酸鹽的轉(zhuǎn)化效率在9

9、8％以上，子宮平滑肌瘤與正常肌層樣本中總體甲基化狀態(tài)差異不明顯(甲基化頻率分別為63.67％±13.21，64.58％±10.54); miR-26a上游啟動(dòng)子序列的四個(gè)CG位點(diǎn)（30位點(diǎn)、99位點(diǎn)、283位點(diǎn)、406位點(diǎn)）在子宮平滑肌瘤與正常肌層中的甲基化頻率分別為73.33％±23.38,58.33％±24.83;68.33％±14.72,56.67％±19.66;70％±8.94，70％±12.65;51.67％±7.53，73.

10、33％±16.33），其中406位點(diǎn)在子宮平滑肌瘤組織中的甲基化頻率明顯低于正常肌層組織(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膠原酶單次消化法高效獲得了原代培養(yǎng)的子宮平滑肌瘤細(xì)胞，可為子宮肌瘤體外實(shí)驗(yàn)研究提供細(xì)胞模型;miR-26a低表達(dá)能增加子宮平滑肌瘤細(xì)胞對(duì)雌、孕激素的敏感性，而促進(jìn)子宮肌瘤的發(fā)生，這可能是通過(guò)miR-26a調(diào)控ERα、PRa的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，說(shuō)明miR-26在子宮平滑肌瘤發(fā)病中起重要作用;子宮平滑肌瘤中m