DNA甲基化對LRP1表達(dá)的影響及其在冠心病發(fā)病機(jī)制中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是威脅人類健康的重要疾病，與其相關(guān)的心腦血管疾病在發(fā)達(dá)國家和我國占死亡率第一位。AS血管病變斑塊的產(chǎn)生和進(jìn)展是由于血管壁細(xì)胞吞噬膽固醇脂并導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)的堆積所致，在該過程中低密度脂蛋白受體家族(LDLRs)中的多種受體發(fā)揮了重要作用，其中(LRPl)尤其受到重視。早期的研究發(fā)現(xiàn)LRRl內(nèi)吞是膽固醇脂進(jìn)入細(xì)胞的重要途徑，且不受細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)濃度的調(diào)節(jié)，因此LRRl一直被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化中泡沫細(xì)胞形成的重要因素之一，其本

2、身可能起促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。但是近來的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞LRPl功能缺陷小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變反而更加嚴(yán)重，推測LRPl在動(dòng)脈粥樣硬化病程中可能有保護(hù)作用，而這和早期少量樣本研究中發(fā)現(xiàn)的冠心病患者單核細(xì)胞可能高表達(dá)LRRl相矛盾，目前資料還難以清楚解釋這種現(xiàn)象。新近在對腫瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可能參與LRRl基因表達(dá)調(diào)節(jié)的線索，但是其在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中的作用目前尚不清楚，本課題就此展開研究。 目的：

3、 通過較大樣本觀察正常人和冠心病患者單核細(xì)胞LRPl的表達(dá)情況，并在不同年齡段進(jìn)行亞組分析，著重觀察分析不同年齡段冠心病患者和正常人LRPl表達(dá)的差異；研究正常人和冠心病患者單核細(xì)胞LRRl基因啟動(dòng)子區(qū)域附近基因甲基化情況，分析其是否影響LRRl的基因表達(dá)。在體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞和人血管平滑肌細(xì)胞中，給予DNA甲基化抑制劑5一脫氧雜氮胞苷改變其DNA甲基化狀態(tài)，觀察其是否影響LRPl的表達(dá)，并進(jìn)一步觀察DNA甲基化狀態(tài)不同是否影響細(xì)胞的

4、生物學(xué)行為特征。 方法： 采用橫斷面研究方法，分別收集110位不同年齡段正常體檢志愿者、112例冠心病患者外周血單核細(xì)胞，采用RT-PCR方法檢測LRPl的mRNA的表達(dá)情況，采用蛋白印跡法測定LRPl蛋白濃度；并從外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA，采用亞硫酸氫鈉測序方法檢測LRPl基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較不同組間是否存在差異，以及年齡和基因甲基化水平、LRRl的表達(dá)情況是否存在相關(guān)。體外培養(yǎng)

5、單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，給予DNA甲基化抑制劑5.脫氧雜氮胞苷，并分別給予不同細(xì)胞因子刺激干預(yù)后收集細(xì)胞測定LRRl蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測LRRl的表達(dá)情況，采用臺(tái)盼蘭染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)、四唑鹽(MTT)比色法觀察細(xì)胞的增殖，刮傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头z測細(xì)胞的遷移并對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 在年齡<50歲的冠心病患者中，LRPl的mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)處于較高水平，其基因的甲基化狀態(tài)和同年齡段正常人相比無顯著差異；年

6、齡>50歲的冠心病患者和正常同齡對照組相比，L,RPl的表達(dá)差異消失，其mRNA和蛋白表達(dá)均處于相同水平，該年齡段正常人和冠心病患者的L,RPl基因的DNA甲基化水平均有升高，而冠心病患者的I,RPl基因啟動(dòng)子區(qū)域附近的DNA甲基化水平升高更加明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。體外培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)：5-脫氧雜氮胞苷干預(yù)會(huì)影響單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞LRRl的mRNA和蛋白表達(dá)，干預(yù)后其表達(dá)水平升高：5-脫氧雜氮胞苷干預(yù)的血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為

7、特性改變，其血小板源性生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移受到抑制。 結(jié)論： 1.LRRl在早發(fā)冠心病患者(年齡<50歲)中高表達(dá)，但是在50歲以上年齡患者中這種差異消失。這種改變可能導(dǎo)致了LRRl在冠心病的不同階段發(fā)揮不同作用，由早期的代償性保護(hù)作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇賱?dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。50歲以上冠心病患者LRPl的基因啟動(dòng)子附近區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)升高可能是導(dǎo)致LRPl表達(dá)降低的機(jī)制之一。 2.單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞L