Hedgehog通路中PTCH1基因表達(dá)及其甲基化在人胃癌發(fā)病中的作用研究.pdf

1、[目的]研究PTCH1基因在人胃癌組織、癌旁正常組織及人胃癌細(xì)胞株AGS中的表達(dá)以及其甲基化異化分析，從而探索Hedgehog通路中PTCH1基因表達(dá)及其甲基化在人胃癌發(fā)病中的作用。 [方法]應(yīng)用半定量RT-PCR以及實(shí)時熒光定量PCR(SYBR Real-time PCR)兩種方法檢測PTCH1mRNA在人胃癌組織、癌旁正常組織及人胃癌細(xì)胞株AGS中的表達(dá)的情況以及分布規(guī)律；應(yīng)用BSP(bisulfite sequencing

2、 PCR)方法檢測胃癌組織、癌旁正常組織及人胃癌細(xì)胞株AGS中PTCH1基因甲基化情況，通過MTT比色法檢測經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc藥物干預(yù)后的AGS細(xì)胞的生長，AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測經(jīng)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc藥物干預(yù)后的AGS細(xì)胞的凋亡，實(shí)時熒光定量PCR檢測藥物干預(yù)后的AGS細(xì)胞內(nèi)PTCH1mRNA表達(dá)，從而分析胃癌細(xì)胞中PTCH1基因的甲基化情況。最后用免疫組化法檢測PTCH1蛋白在胃癌組織

3、及癌旁組織中的表達(dá)。 [結(jié)果]在胃癌組織、癌旁正常組織及人胃癌細(xì)胞株AGS中均可見PTCH1mRNA的表達(dá)，PTCH1mRNA在胃癌中的相對表達(dá)量1.26±0.896，低于其在癌旁正常胃組織的表達(dá)量2.75±1.667，統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性意義(P＜0.05)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PTCH1mRNA表達(dá)與胃癌腫瘤大小和轉(zhuǎn)移無相關(guān)性，而發(fā)現(xiàn)高中分化胃癌組織中的PTCH1mRNA相對表達(dá)量為1.5815±0.01968，低分化胃癌組織中

4、為1.2345±0.01266，相對表達(dá)量則較低，P＜0.01有統(tǒng)計學(xué)意義。在胃癌組織、癌旁正常組織及人胃癌細(xì)胞株AGS中存在PTCH1基因甲基化狀態(tài)，其中在胃癌組織及胃癌細(xì)胞株AGS中的甲基化狀態(tài)情況明顯高于癌旁正常組織。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株AGS幾乎全部發(fā)生甲基化，甲基化程度99.7％±0.67％，胃癌組織中甲基化程度為16％～100％，平均為62.9％±6.14％。癌旁正常組織甲基化程度為0％～42％，平均為17.7％±3.5

5、9％，三組之間存在顯著差異(P＜0.01)。同時發(fā)現(xiàn)PTCH1mRNA在胃癌組織、癌旁組織及人胃癌細(xì)胞株AGS中表達(dá)與其甲基化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。通過甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dc藥物干預(yù)胃癌細(xì)胞株AGS，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加，通過實(shí)時定量分析，可見經(jīng)5-aza-dc藥物干預(yù)后的AGS細(xì)胞內(nèi)PTCH1mRNA表達(dá)均高于未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞，且不同濃度藥物干預(yù)后的AGS細(xì)胞內(nèi)PTCH1mRNA表達(dá)的情況也不同，5-aza-dc2.0um組PTCH

6、1mRNA相對表達(dá)量為2.25±0.33；5-aza-dc5.0um組PTCH1mRNA相對表達(dá)量為2.24±0.49；5-aza-dc10.0 um組PTCH1mRNA相對表達(dá)量為1.71±0.27。三實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。各組間比較，5-aza-dc2.0um組與5-aza-dc10.0um組PTCH1mRNA表達(dá)有明顯差異，P＜0.05，其余兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。PTCH1蛋白在胃癌組織及癌旁正常組織中

7、均可見陽性表達(dá)，在癌旁組織中的表達(dá)高于胃癌組織，癌旁正常胃組織的陽性率為87.5％(35/40)，胃癌組織中的陽性率為50.0％(20/40)，P=0.001，有統(tǒng)計學(xué)意義。PTCH1蛋白表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，但與分化程度有關(guān)，在低分化組織中表達(dá)率明顯低于中高分化胃癌組織，有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05。 [結(jié)論]在一部分胃癌發(fā)病中存在PTCH1基因甲基化、其mRNA的低表達(dá)及Hedgehog信號通路的異常激活。PTCH1