HDL通過SR-B1介導的PI3K-Akt-eNOS途徑誘導內皮細胞COX-2表達和PGI2生成.pdf

1、研究背景：動脈粥樣硬化血栓形成（atherothrombosis）已成為心肌梗死、血栓性卒中、及周圍血管疾病等多種臨床疾病共同的基本病理過程。動脈粥樣硬化作為一個慢性病理過程，在動脈粥樣硬化形成早期可以無臨床癥狀，而在慢性炎癥等因素的刺激下，粥樣斑塊尤其是脆性斑塊可發(fā)生斑塊侵蝕或破裂并繼發(fā)血小板的粘附、活化、聚積，致急性血栓的形成。而體內存在有天然的抗血小板活化、聚積的抑制物，這些抑制物在防止動脈粥樣硬化及血栓形成過程中起著重要作用。<

2、br>　　前列環(huán)素（prostacyclin, PGI2）是花生四烯酸經環(huán)氧合酶（cyclooxygenase, COX）途徑級聯(lián)催化而生成的一種脂質介質。研究發(fā)現(xiàn) PGI2具有強大的擴血管作用和抗血小板聚積作用。PGI2與TXA2是迄今已知的具有調控血小板功能最強的一對內源性物質，PGI2與TXA2之間的平衡是維持正常血液內環(huán)境相對穩(wěn)定的必要條件。目前升高血液中PGI2的水平已成為了臨床上有效抗血栓治療的靶點。
　　環(huán)氧合酶則是

3、花生四烯酸級聯(lián)催化反應過程中的一個重要限速酶，主要有兩個亞型：結構型(COX-1)和速生型(COX-2)。研究發(fā)現(xiàn) COX-2與動脈粥樣硬化有著密切關系，在動脈粥樣硬化斑塊中 COX-2的表達明顯增高，而且斑塊中COX-2/PGES過度表達與動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有關，但也有越來越多的證據表明COX-2并不完全對機體有害，它能促使炎癥發(fā)生的同時也有著抗炎、抗纖維化及抗血栓等作用。
　　高密度脂蛋白(high density l

4、ipoprotein, HDL)主要由脂質和載脂蛋白成分組成。當前，越來越多的研究顯示HDL具有抗動脈粥樣硬化和血管保護作用，血漿中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平與臨床心血管事件風險性之間存在顯著負相關，且研究還發(fā)現(xiàn)血漿中HDL-C的水平與血漿中PGI2穩(wěn)定產物6-keto-PGF1α的水平呈正相關。體外實驗也得以證實HDL2及HDL3均能劑量依賴性誘導內皮細胞PGI2的釋放，抑制COX-2活性后PGI2生成減少，且HDL中的磷

5、脂成分，1-磷酸-鞘胺醇（Sphingosine-1-phosphate，S1P），可通過細胞膜上的S1P受體介導的p38MAPK/CREB途徑上調平滑肌細胞COX-2的表達與PGI2的釋放。
　　清道夫受體B類1型（Scavenger receptor class B type I，SR-B1）作為體內HDL的生理性相關受體，它可與HDL中apoA1進行特異性識別、結合，進而介導HDL抗炎、抗血栓、抗氧化、抗內皮損傷等作用。HD

6、L與SR-B1受體結合后可經PI3K-Akt/MAPK途徑活化內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS），增加NO的生成以及激活Rac，最終促使內皮細胞形成偽足、遷移，進而修復內皮損傷。
　　第一部分 SR-B1在HDL誘導內皮細胞PGI2釋放中的作用
　　目的：SR-B1做為HDL的生理性相關受體，它是否也在HDL誘導內皮細胞PGI2生成中發(fā)揮作用。故本實驗的目的也

7、就是觀察SR-B1受體在HDL誘導內皮細胞PGI2釋放過程中的作用。
　　方法：1.不同濃度（30μ g/ml、60μ g/ml、120μ g/ml）apoA1處理ECV304細胞24小時；30μ g/ml apoA1處理不同時間（3、6、12、24小時）；30μ g/ml apoA1及1μ mol/L S1P處理內皮細胞24小時。2.轉染pcDNA3.1(-)-hSR-B1重組表達質粒48小時后，30μ g/ml HDL孵育24

8、小時。3.轉染SR-B1 siRNA48小時后，30μ g/ml HDL孵育24小時。設空白組作對照，以30μ g/ml HDL處理組為陽性對照，熒光顯微鏡下鑒定轉染效率；RT-PCR和/（或）Western blot檢測SR-B1 mRNA與蛋白的表達；ELISA法檢測培養(yǎng)液中6-keto-PGF1α的生成。
　　結果：30μ g/ml apoA1處理12小時可以使PGI2生成增加，且24小時達高峰；而濃度實驗中發(fā)現(xiàn)在30μ g

9、/ml濃度時即可見PGI2生成增加，但隨后PGI2生成并沒有隨apoA1濃度的增高而增加；30μ g/ml HDL、1μ M S1P均能顯著增加內皮細胞PGI2的釋放，而apoA1雖能增加內皮細胞PGI2的釋放，但其升高的幅度比HDL、S1P要低。轉染pcDNA3.1(-)-hSR-B1重組表達質粒過表達SR-B1受體后， Western blot檢測SR-B1蛋白表達成功上調，但過表達SR-B1沒能顯著增加HDL誘導內皮細胞PGI2的

10、生成。RT-PCR、Western blot檢測SR-B1三對siRNA序列均能下調SR-B1 mRNA及蛋白的表達，但其中以SR-B1 siRNA-S2作用最為明顯，轉染SR-B1 siRNA-S248小時后再與HDL孵育24小時，能顯著減少HDL所誘導的內皮細胞PGI2生成。
　　第二部分SR-B1介導HDL誘導內皮細胞PGI2釋放的機制探討
　　目的：前期實驗結果顯示SR-B1參與介導HDL誘導內皮細胞PGI2的生成，

11、故本實驗主要探討SR-B1影響HDL誘導內皮細胞PGI2釋放的可能機制。
　　方法：1.分別轉染pcDNA3.1(-)-hSR-B1重組表達質?；騍R-B1 siRNA48小時后，30μ g/ml HDL孵育24小時；2.30μ g/ml apoA1與ECV304內皮細胞共孵育24小時；3.分別用25μ mol/L PI3K特異性抑制劑LY294002或50μ mol/L eNOS特異性抑制劑L-NAME預處理3小時后，30μ g

12、/ml HDL孵育24小時?？瞻捉M作為陰性對照，30μ g/ml HDL處理組為陽性對照，RT-PCR和/（或）Western blot檢測PGIS、COX-2、CREB及磷酸化CREB的表達；免疫細胞化學法檢測內皮細胞中COX-2蛋白的表達；ELISA法檢測培養(yǎng)液中6-keto-PGF1α的生成。
　　結果：不管是mRNA水平還是蛋白水平，在過表達SR-B1后， HDL均不能顯著上調COX-2的表達，然而，有趣地是siRNA沉默

13、SR-B1后，可見HDL誘導內皮細胞COX-2的表達明顯減少，且免疫細胞化學檢測能得到相似的結果。30μ g/ml apoA1孵育內皮細胞24小時后，COX-2表達亦出現(xiàn)增加。但是，不管是HDL單獨處理還是過表達或沉默SR-B1，PGIS的表達都沒有明顯變化。抑制劑單獨處理細胞對 PGI2的生成沒影響，但抑制 PI3K或 eNOS活性后可明顯減少HDL誘導的PGI2生成，其中以抑制PI3K活性后，PGI2生成減少更為顯著；同樣，LY29

14、4002或L-NAME對HDL誘導內皮細胞COX-2、磷酸化CREB表達的影響與影響PGI2的生成呈相同效果，特異性抑制PI3K和特異性抑制eNOS活性均能下調HDL誘導的COX-2表達及CREB磷酸化，且同樣以抑制PI3K后下調幅度更為明顯。
　　結論：
　　1. HDL誘導內皮細胞COX-2的表達與PGI2的釋放部分依賴HDL受體SR-B1。
　　2.抑制內皮細胞PI3K或eNOS活性可下調HDL誘導的內皮細胞CR