IGF-Ⅱ通過Erk1-2MAPK及PI3K-AKT途徑上調(diào)宮頸癌細(xì)胞中KCC1的基因表達(dá)及意義.pdf

1、目的: 宮頸癌是世界范圍內(nèi)女性生殖系統(tǒng)第二大腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，發(fā)病年齡亦呈現(xiàn)年輕化趨勢，已成為威脅婦女健康的主要問題。在眾多有關(guān)宮頸癌的基礎(chǔ)性研究中，人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染作為宮頸癌的病因已得到越來越廣泛的證實(shí)。然而，在HPV感染的婦女中，只有少數(shù)可發(fā)展成為宮頸癌，這表明，在HPV感染的基礎(chǔ)上，仍存在著大量最終導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的其他因素。目前宮頸癌病因?qū)W的研究主要集中于癌基因，抑癌基因以及與之相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活

2、性調(diào)節(jié)蛋白等遺傳，生理及病理學(xué)方面，而對于宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中病理生理學(xué)改變的研究還少有報(bào)道。在正常宮頸上皮細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化和演進(jìn)的過程中，維持細(xì)胞自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及其與之相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)外調(diào)節(jié)因素及信號(hào)傳導(dǎo)通路活性的改變目前還不十分了解。 鉀氯共同轉(zhuǎn)運(yùn)子(KCC)是細(xì)胞表面膜蛋白，分為四種亞型，其中KCC1，KCC3和KCC4能夠介導(dǎo)K，CI離子在胞膜水平的成對移動(dòng)，它們的活化在細(xì)胞體積調(diào)節(jié)，上皮運(yùn)輸及離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮

3、著重要的作用。在前期的研究中，利用免疫組化及免疫熒光技術(shù)檢測宮頸癌組織中KCC1的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其較正常宮頸組織及宮頸癌前病變組織呈現(xiàn)明顯上升趨勢。為進(jìn)一步探討影響KCC1基因表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)外調(diào)節(jié)因素，本研究采用PCR及Western-blot的方法檢測人宮頸癌SiHa細(xì)胞接受IGF-Ⅱ作用后其表面KCC1mRNA及蛋白的表達(dá)情況，并對這一過程中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化進(jìn)行檢測。 方法: 1、應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT

4、-PCR)技術(shù)及Western-blot技術(shù)檢測不同時(shí)間不同濃度IGF-Ⅱ作用下，宮頸癌SiHa細(xì)胞中KCC1 mRNA及蛋白表達(dá)的變化。 2、應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測不同時(shí)間不同濃度IGF-Ⅱ作用下，宮頸癌SiHa細(xì)胞中Erk1/2，p—Erk1/2及AKT，p-AKT的蛋白表達(dá)情況，以此探討這一過程中Erk1/2MAPK及PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化情況。 3、在加入針對Erk1/2MAPK及PI3

5、K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的特異性通路阻滯劑后，以不同時(shí)間不同濃度IGF-Ⅱ作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞，觀察其KCC1蛋白表達(dá)的情況。 結(jié)果: 1、采用RT—PCR法檢測IGF-Ⅱ?qū)m頸癌SiHa細(xì)胞KCC1 mRNA表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，隨著IGF-Ⅱ作用濃度的加大及作用時(shí)間的延長，KCC1的mRNA含量逐漸升高。與空白對照組相比，IGF-Ⅱ 100mmol/L、50mmol/L組的KCC1mRNA含量顯著升高，IGF-Ⅱ 10

6、mol/L組KCC1mRNA含量亦有升高。與空白對照組相比，IGF-Ⅱ作用后1小時(shí)即可檢測到KCC1mRNA表達(dá)的增高，且隨著時(shí)間的延長(3小時(shí)，6小時(shí))，其表達(dá)有逐漸升高趨勢。 2、Western blot檢測IGF-Ⅱ?qū)m頸癌SiHa細(xì)胞KCC1蛋白表達(dá)的影響與KCC1mRNA表達(dá)結(jié)果相一致，隨著IGF-Ⅱ作用濃度的加大及作用時(shí)間的延長，KCC1蛋白表達(dá)逐漸升高。與空白對照組相比，IGF-Ⅱ 100ng/mL，50ng/mL

7、，10 ng/mL組的KCC1mRNA含量升高，IGF-Ⅱ作用后1小時(shí)即可檢測到KCC1蛋白表達(dá)的增高，且隨著時(shí)間的延長(3小時(shí)，6小時(shí))，其表達(dá)有逐漸升高趨勢。 3、Western blot檢測顯示在IGF-Ⅱ作用下，宮頸癌SiHa細(xì)胞中Erk1/2及AKT蛋白磷酸化增強(qiáng)，隨著時(shí)間的延長，兩種蛋白磷酸化逐漸增強(qiáng)，該趨勢與KCC1蛋白表達(dá)的增加一致。 4、在Erk1/2MAPK及PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑特異性阻滯劑后

8、，以最大濃度最長時(shí)間的IGF-Ⅱ作用細(xì)胞，Western blot檢測顯示在Erk1/2及AKT磷酸化未見明顯增強(qiáng)的同時(shí)，宮頸癌SiHa細(xì)胞中KCC1的基因表達(dá)亦未見明顯的增加。 結(jié)論: 1、IGF-Ⅱ可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞中KCC1的基因表達(dá)，且這種作用具有一定的時(shí)間濃度依賴性。 2、IGF-Ⅱ上調(diào)KCC1的基因表達(dá)可能是通過Erk1/2MAPK及P13K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的，KCC可能在IGF-Ⅱ?qū)m頸癌的促