耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 由耐碳青霉烯多重耐藥不動(dòng)桿菌引起的嚴(yán)重院內(nèi)感染近年呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，使臨床醫(yī)生面臨巨大的挑戰(zhàn)，對(duì)其耐藥機(jī)制的研究成為了一個(gè)重要的課題。本試驗(yàn)采用分子生物學(xué)方法研究鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株對(duì)亞胺培南和美洛培南耐藥機(jī)制包括細(xì)菌產(chǎn)OXA型碳青霉烯酶和外膜孔通道蛋白的缺失，為指導(dǎo)醫(yī)生合理使用抗菌藥物，以克服或減少細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)或傳播，以及新型抗菌藥物的研制提供依據(jù)。 方法： 1、菌株：從收集的天津市2001年～20

2、05年鮑曼不動(dòng)桿菌20株臨床株中篩選出對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物(亞胺培南和美洛培南)耐藥的菌株。 2、藥敏試驗(yàn)：采用瓊脂紙片擴(kuò)散法(K-B法)和微量肉湯稀釋法測(cè)定臨床菌株對(duì)13種常用抗菌藥物的敏感性。 3、PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶bla<,OXA-23-like>基因：根據(jù)GenBank公布的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)bla<,OXA-23>和bIa<,OXA-27>基因的通用引物。上游引物SQ1 5'-GATGTGTCATAGTATTCG

3、TCG-3'，定位于編碼基因開(kāi)放可讀框的-108～-88位堿基；下游引物SQ2 5'-TCACAACAACTAAAAGCACTG-3'，定位于編碼基因開(kāi)放可讀框的+930～+950位堿基，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。 4、外膜蛋白提取及進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。 5、PCR擴(kuò)增外膜蛋白carO基因：根據(jù)GenBank公布的序列，設(shè)計(jì)carO基因的特異性引物。上游引

4、物OMP1 5'-ATGAAAGTATTACGTGTTTTAGTG-3'，定位于carO基因+1～+24位堿基；下游引物OMP2 5'-TTACCAgTAgAAgTTTACACC-3'，定位于carO基因+724～+744位堿基，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。 6、 PCR產(chǎn)物序列分析。 結(jié)果： 1、藥敏試驗(yàn)：從20株鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床株中篩選出3株對(duì)亞胺培南和美洛培南耐藥的臨床株AB13、A

5、B24和AB173，對(duì)13種臨床常用的抗菌藥物的藥敏結(jié)果顯示：AB13、AB24和AB173除對(duì)氧氟沙星、左氧氟沙星呈敏感外，對(duì)環(huán)丙沙星低度耐藥，并且?guī)缀鯇?duì)所有測(cè)試的β-內(nèi)酰胺類(lèi)(哌拉西林、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢氨噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦)、氨基糖甙類(lèi)(阿米卡星、慶大霉素)和四環(huán)素高度耐藥，為多重耐藥株。 2、bla<,OXA-23-like>婦基因PCR-DNA序列分析：使用引物SQl和SQ2，3株耐藥臨床

6、株AB13、AB24、AB173 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均出現(xiàn)一條1058bp大小的陽(yáng)性條帶，1株敏感株AB942和對(duì)照菌株大腸埃希菌ATCC25922、嗜麥芽窄食單胞菌Sme006 PCR擴(kuò)增均呈陰性。3條PCR產(chǎn)物全部進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示AB13、AB24和AB173編碼序列完全一致，與GenBank中的bla<,OXA-23>基因序列對(duì)比未出現(xiàn)變異，一致性100％。 3、外膜蛋白電泳： SDS-PAGE分析顯示與敏感株AB942

7、電泳條帶相比較，耐碳青霉烯臨床株AB173的外膜蛋白電泳條帶在29KDa處出現(xiàn)明顯缺失，其余2株耐碳青霉烯臨床株AB13、AB24無(wú)明顯條帶差異。 4、CARO基因PCR-DNA序列分析：使用引物OMP1和OMP2，對(duì)carO基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示碳青霉烯敏感的臨床株AB942、碳青霉烯耐藥的臨床株AB13和AB24(SDS-PAGE凝膠電泳條帶無(wú)變化)、碳青霉烯耐藥的臨床株AB173(SDS-PAGE凝膠電泳29KDa條

8、帶處缺失)在744bp處均出現(xiàn)了陽(yáng)性擴(kuò)增條帶。將AB942、AB13、AB173的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，與GenBank中的carO基因序列(AY684798)比較相似性分別是81％、80％、77％。根據(jù)編碼區(qū)堿基序列推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中的CarO蛋白氨基酸序列(AAV80243)相似性分別是76％、72％、74％。 結(jié)論： 3株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株都攜帶bla<,OCS-23>基因，其中一株還伴有