耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌臨床株耐藥機制的研究.pdf

1、目的：
　　 碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染的一線藥物，由于此類抗生素應(yīng)用的增多，對碳青霉烯耐藥的臨床株陸續(xù)出現(xiàn)。根據(jù)中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測-CHINET監(jiān)測，2009年腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素的總耐藥率已經(jīng)超過1％，相比2008年有增加的趨勢。腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的機制主要包括產(chǎn)碳青霉烯酶和外膜蛋白的缺失伴或不伴高水平的β-內(nèi)酰胺酶(AmpC酶、ESBLs等)的產(chǎn)生。本實驗主要采用分子生物學(xué)的方

2、法研究腸桿菌科細(xì)菌臨床株對碳青霉烯耐藥的機制，從而為指導(dǎo)醫(yī)生合理使用抗菌藥物，避免或減少細(xì)菌耐藥性的、現(xiàn)或傳播、新型抗菌藥物的開發(fā)及新型作用靶位的研制提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、菌株收集與藥敏試驗：從2009年3月至2010年4月天津市某三甲醫(yī)院臨床分離出腸桿菌科細(xì)菌227株，其中多重耐藥菌株41株。根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2010年標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法和瓊脂紙片擴散法測定臨床菌株12種常用

3、抗菌藥物(左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、氧氟沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢氨噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、慶大霉素)的MIC值及3種常用碳青霉烯類抗生素(亞胺培南、美羅培南、厄他培南)的抑菌圈直徑，了解腸桿菌科細(xì)菌臨床株對碳青霉烯耐藥的情況。
　　 2、碳青霉烯酶檢測：通過碳青霉烯酶確證試驗-改良Hodge試驗和金屬酶篩選試驗-EDTA協(xié)同試驗初步判定耐碳青霉烯臨床株是否產(chǎn)碳青霉烯酶，通過PCR擴增常見

4、的5種碳青霉烯酶基因，包括KPC酶，金屬酶(IMP型、VIM型及NDM-1型)以及OXA-48型碳青霉烯酶，了解碳青霉烯耐藥臨床株碳青霉烯酶基因攜帶情況。
　　 3、外膜蛋白研究：對耐碳青霉烯菌株及敏感株的外膜蛋白進行聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)，對比外膜蛋白的缺失情況，即陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌及肺炎克雷伯菌的與耐藥有關(guān)的外膜蛋白OmpF、OmpE36和OmpK36/35，在SDS-PAGE圖譜上分別可見為38KDa、

5、42KDa、39KDa/37KDa大小的條帶。PCR擴增編碼OmpF、OmpE36和OmpK36/35外膜蛋白的基因，進行DNA和氨基酸序列分析及跨膜片段的預(yù)測。
　　 4、其他β-內(nèi)酰胺酶檢測：通過PCR檢測耐碳青霉烯菌株其他β-內(nèi)酰胺酶基因的攜帶情況，包括常見的廣譜及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(TEM、SHV及CTX-M-1、2、9組ESBLs)和DHA型質(zhì)粒AmpC酶基因。
　　 結(jié)果：
　　 1、藥敏試驗：從

6、227株腸桿菌臨床株中篩選出6株對碳青霉烯耐藥的臨床株(2株陰溝腸桿菌E2414、E2166，3株產(chǎn)氣腸桿菌Ea2880、Ea293、Ea391，1株肺炎克雷伯菌Kp382)，分離率為2.6％，占多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌的14.6％。6株耐藥菌對厄他培南、頭孢類抗生素以及含酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺酶類耐藥率均達(dá)到100％，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率為50％，對氨基糖苷類、氟喹諾酮類抗生素耐藥率分別為83.34％和66.67％。其中有3株(E2

7、414，Ea391，Kp382)為泛耐藥菌株(對抗假單胞菌頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢吡肟)、抗假單胞菌碳青霉烯類(亞胺培南、美羅培南、厄他培南)、含有β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑、氟喹諾酮類和氨基糖苷類均耐藥)。
　　 2、碳青霉烯酶檢測：6株耐碳青霉烯臨床株中有3株改良Hodge試驗陽性，包括E2414，Ea391和Kp382，提示可能產(chǎn)碳青霉烯酶。6株耐藥菌的EDTA協(xié)同試驗均為陰性，提示可能不產(chǎn)金屬酶。PCR擴增常見的5種碳

8、青霉烯酶基因，包括KPC酶，金屬酶(IMP型、VIM型及NDM-1型)以及OXA-48型碳青霉烯酶，均為陰性結(jié)果，提示6株耐藥菌可能不攜帶這幾種碳青霉烯酶。3株改良Hodge試驗陽性而不攜帶常見的碳青霉烯酶，推測可能因攜帶其他碳青霉烯酶基因介導(dǎo)耐藥(如IMI型酶等)，或有其他耐藥機制參與(如外膜蛋白的缺失)。
　　 3、外膜蛋白研究：SDS-PAGE外膜蛋白圖譜及相關(guān)外膜蛋白基因檢測表明，2株陰溝腸桿菌(E2414和E2166)

9、缺失與碳青霉烯耐藥相關(guān)的38KDa大小的條帶，PCR擴增相關(guān)基因OmpF，證實基因缺失。3株產(chǎn)氣腸桿菌中Ea2880和Ea293缺失與碳青霉烯耐藥相關(guān)的42KDa大小的條帶，PCR擴增相關(guān)基因OmpE36，Ea293存在OmpE36基因的缺失，Ea2880擴增出OmpE36基因，經(jīng)序列分析顯示Ea2880與GenBank公布的產(chǎn)氣腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13048的DNA及氨基酸序列差異較大，相似性均為87％，對該蛋白質(zhì)進行跨膜片段的預(yù)測，

10、顯示二者均有12個跨膜片段，其中第7個跨膜片段存在差別。另一株產(chǎn)氣腸桿菌Ea391在外膜蛋白圖譜上無明顯變化，但PCR擴增相關(guān)的外膜蛋白基因OmpE36，證實基因缺失。1株肺炎克雷伯菌Kp382在外膜蛋白圖譜上無明顯變化，但PCR擴增相關(guān)的外膜蛋白基因OmpK36/35，證實基因缺失。
　　 4、其他β-內(nèi)酰胺酶檢測：對6株耐碳青霉烯臨床株P(guān)CR擴增常見的廣譜及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(TEM、SHV及CTX-M-1、2、9組ES

11、BLs)和DHA型質(zhì)粒AmpC酶基因。陰溝腸桿菌E2414攜帶TEM-1型廣譜酶及CTX-M-9組ESBLs；產(chǎn)氣腸桿菌Ea2880攜帶SHV-11型及CTX-M-9組ESBLs，Ea391攜帶TEM-1型廣譜酶；肺炎克雷伯菌Kp382和陰溝腸桿菌E2166均為陰性。
　　 結(jié)論：
　　 1、在天津某醫(yī)院從227株腸桿菌科細(xì)菌臨床株中已分離到6株耐碳青霉烯的菌株，分離率為2.6％，其中3株為泛耐藥菌株。
　　 2

12、、6株耐碳青霉烯臨床株中尚未檢測到常見的碳青霉烯酶基因，但E2414攜帶CTX-M-9組ESBLs，Ea2880攜帶SHV-11型及CTX-M-9組ESBLs。
　　 3、外膜蛋白圖譜及相關(guān)外膜蛋白基因檢測表明，6株耐碳青霉烯臨床株均存在外膜蛋白的缺失或外膜蛋白基因的缺失或突變。
　　 4、總之，從天津某醫(yī)院分離的6株耐碳青霉烯臨床株對碳青霉烯耐藥的主要原因可能不是產(chǎn)常見的碳青霉烯酶。外膜蛋白的缺失或外膜蛋白基因的缺失或