碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的: 本研究通過了解我院鮑曼不動(dòng)桿菌感染情況、耐藥特征與流行趨勢(shì)，研究重癥監(jiān)護(hù)病房臨床菌株與環(huán)境菌株耐藥特征，檢測(cè)耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌水解酶及外排泵基因，檢測(cè)主動(dòng)外排系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因在亞胺培南耐藥組(imipenem-resistant Acinetobacter baumannii IRAB)與敏感組(imipenem-sensitiveAcinetobacter baumannii ISAB)中分布差異，對(duì)主要外排基因進(jìn)

2、行表達(dá)量分析，并研究外膜蛋白Omp34介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥，深入探討鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制。
　　方法: 1、本實(shí)驗(yàn)收集2012年7月到10月我院臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌共78株，并采用ERIC-PCR及PFGE技術(shù)對(duì)該78株臨床分離株進(jìn)行同源性分析，了解本院鮑曼不動(dòng)桿菌是否存在克隆株的播散流行。2、同期采用瓊脂稀釋法檢測(cè)神經(jīng)外科重癥監(jiān)護(hù)病房(Intensive Care Unit，ICU)27株臨床菌株和

3、28株環(huán)境菌株對(duì)常用抗菌藥物的最低抑菌濃度;用腸桿菌科基因間重復(fù)序列PCR(Enterbacteriat Repetitive IntergenicConsensus，ERIC-PCR)、多位點(diǎn)序列分型(Multi Locus Sequence Typing，MLST)及脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed Field Gelelectrophoresis，PFGE）技術(shù)對(duì)共分離的55株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行基因分型，分析其可能的傳播途徑。3、采用聚

4、合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChain Reaction，PCR)檢測(cè)78株臨床菌株β-內(nèi)酰胺酶基因(OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP-1、VIM-1、VIM-2、Amp-C)及RND家族3個(gè)主要外排系統(tǒng)AdeABC、AdeIJK及AdeFGH結(jié)構(gòu)基因(adeB、adeJ、adeF、adeG、adeH)與調(diào)控基因(adeR、adeS、adeL)的攜帶情況，比較其在IRAB及ISAB中分布差異，進(jìn)一步使用

5、Realtime-PCR對(duì)其主要外排基因進(jìn)行表達(dá)量分析，初步探討鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥機(jī)制。4、研究通過采用雙重同源重組技術(shù)在鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606中構(gòu)建Omp34基因的缺失突變株(ATCC19606-△Omp34)，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳分析外膜蛋白的表達(dá)，PCR法和基因測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證Omp34基因

6、敲除。比較野生株和敲除株對(duì)常用抗菌藥物尤其是碳青霉烯類的抑菌圈大小，以探討外膜蛋白Omp34在介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥中的作用。
　　結(jié)果: 1、臨床分離78株鮑曼不動(dòng)桿菌只對(duì)米諾環(huán)素耐藥率稍低，為30.9％;其次為亞胺培南，耐藥率為53.1％;對(duì)其它抗菌藥物耐藥率均超過60％;對(duì)頭孢西丁、復(fù)方新諾明耐藥率最高，分別為97.5％、93.8％。78株鮑曼不動(dòng)桿菌ERIC-PCR結(jié)果顯示可分為A、B、C、D、E、F6型，A型6

7、2株，為主要克隆株，其中A型又分為A1型46株，A2型16株，B型7株，C型6株，D、E、F型各1株。PFGE主要分為7型，A型56株（包括A1、A2、A3三個(gè)亞型），B型7株，C型4株，D型5株，E型3株，F(xiàn)型2株、G型1株。2、臨床分離27株鮑曼不動(dòng)桿菌除對(duì)替加環(huán)素、粘菌素全部敏感，對(duì)其他14種抗菌藥物普遍耐藥，米諾環(huán)素耐藥率稍低，為25.9％。其次為頭孢哌酮/舒巴坦與亞胺培南，耐藥率分別為51.9％、59.3％，對(duì)其他抗菌藥物的耐

8、藥率均超過70％，對(duì)復(fù)方新諾明全部耐藥。環(huán)境分離28株鮑曼不動(dòng)桿菌相比臨床分離菌株更為敏感，替加環(huán)素和粘菌素全部敏感，對(duì)美羅培南和頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率均為3.6％，對(duì)與亞胺培南耐藥率為7.1％，對(duì)米諾環(huán)素、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率均為10.7％，對(duì)頭孢西丁耐藥率最高，為92.9％。27株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌ERIC-PCR基因分型主要為A、B、C三型，其中A型20株，B型6株，C型1株。28株環(huán)境分離鮑曼不動(dòng)桿菌主要可分為6型，A型

9、13株，B型4株，C型2株，D型4株，E型2株，F(xiàn)型3株。27株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌MLST分為5個(gè)ST型(ST208，1-3-3-2-2-97-3;ST368,1-3-3-2-2-140-3; ST191,1-3-3-2-2-94-3; ST195,1-3-3-2-2-96-3; ST540,1-3-3-2-2-160-3)與4個(gè)新ST型。其中ST208是在神經(jīng)外科ICU中分布最為廣泛的基兇型，占到了菌株數(shù)的66.7％，環(huán)境菌株中ML

10、ST主要有2個(gè)ST型（ST208和ST229)。27株臨床分離菌株P(guān)FGE可分為5型，其中A型23株（包括A1型15株，A2型7株，A3型1株），B型1株，D型2株，E型1株，28株ICU環(huán)境分離株主要分為9型，其中A型15株（包括A1型7株，A2型2株，A3型6株），B型2株，C型1株，D型2株，E型3株，F(xiàn)型2株，G、H、I型各1株。3、在78株鮑曼不動(dòng)桿菌中，均檢測(cè)到OXA-51，未檢測(cè)到OXA-24、OXA-58、VIM-1、V

11、IM-2基因。AmpC、OXA-23、IMP-1基因的檢測(cè)率分別為84.6％、74.3％、56.4％。66株檢測(cè)到Amp-C，其中42株為IRAB，22株ISAB。58株OXA-23陽(yáng)性包括42株IRAB，12株ISAB。44株檢測(cè)到IMP-1，其中23株為IRAB，19株為ISAB。加入外排泵抑制劑PAβN，78株鮑曼不動(dòng)桿菌分離株中，41株(52.5％)對(duì)亞胺培南的MICs有了4～32倍的降低，可認(rèn)為外排泵表型陽(yáng)性。在AdeABC外

12、排系統(tǒng)中，adeB、adeS、adeR基因的檢出率為77％、77％、73％。60株adeB陽(yáng)性菌株中，39株為IRAB，19株為ISAB。在78株臨床菌株中，檢測(cè)到adeJ基因72株(92％)，其中42株為IRAB，28株為ISAB。adeL、adeF、adeG和adeH的檢出率分別為94％、97％、90％和92％。70株adeG陽(yáng)性菌株包括42株IRAB和26株ISAB。對(duì)8株IRAB和8株ISAB進(jìn)一步使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)主要外

13、排基因adeB、adeJ和adeG進(jìn)行表達(dá)量分析，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析adeB和adeG在IRAB和ISAB中表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、通過PCR試驗(yàn)成功構(gòu)建ATCC19606-△Omp34基因敲除株，并通過基因測(cè)序驗(yàn)證。SDS-PAGE蛋白電泳顯示，敲除株較野生株在34kDa處有一個(gè)蛋白缺失，說明Omp34基因敲除成功。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示野生株和敲除株對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性沒有顯著改變。
　　結(jié)論: 我院神經(jīng)外科ICU鮑曼不動(dòng)

14、桿菌對(duì)替加環(huán)素和粘菌素全部敏感，對(duì)米諾環(huán)素耐藥率稍低，其次為頭孢哌酮/舒巴坦和亞胺培南。臨床可根據(jù)藥敏結(jié)果選擇合適抗菌藥物。A型克隆株為我院鮑曼不動(dòng)桿菌主要流行株，臨床菌株與環(huán)境菌株具有較高同源性，且同時(shí)分布于其他多個(gè)科室，科室間存在交叉感染的可能性，需采取切實(shí)有效的措施及時(shí)進(jìn)行干預(yù)。產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶Amp-C、OXA-23與主動(dòng)外排系統(tǒng)AdeABC、AdeFGH過表達(dá)在鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯耐藥中發(fā)揮重要作用。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野生