TGFβ1和TGFβ3在維甲酸誘導(dǎo)腭裂以及正常小鼠腭部的表達(dá).pdf

1、目的： 腭裂(cleft of palate)是一種常見(jiàn)的先天發(fā)育畸形，在顱頜面畸形中占絕大部分。它的發(fā)生給患者及家屬的生活和心理帶來(lái)了較大的影響。目前，已有學(xué)者就腭裂發(fā)生機(jī)制做出了較多的基礎(chǔ)及臨床方面的研究，并取得了一定的成就。但它是一種多基因遺傳病，目前其發(fā)病機(jī)制仍不甚明確。腭裂發(fā)病機(jī)制的研究可以為腭裂的預(yù)防和產(chǎn)前診斷提供廣闊的前景。 維甲酸(retinoic acid，RA)在生物體的胚胎發(fā)育、器官形成、細(xì)胞分化和

2、維持正常的生理穩(wěn)態(tài)中起重要作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，內(nèi)源性維甲酸與正常的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。過(guò)量的維甲酸有明顯的毒副作用，可以使基因錯(cuò)誤表達(dá)從而導(dǎo)致胚胎的異常發(fā)育，誘導(dǎo)組織器官畸形形成。維甲酸信號(hào)的功能最終是通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及其受體、激素、轉(zhuǎn)錄因子、激酶及磷酸酶、細(xì)胞內(nèi)酶和效應(yīng)因子等，都受維甲酸的調(diào)節(jié)。近年來(lái)國(guó)外學(xué)者對(duì)維甲酸(retinoic acid，RA)調(diào)控基因表達(dá)與其誘導(dǎo)腭裂形成的關(guān)系進(jìn)行了研究，但RA

3、誘導(dǎo)腭裂畸形的機(jī)制仍不明確。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p超家族(transforming growth factor β，TGFβ)是一類(lèi)具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在多方面參與胚胎發(fā)育，它對(duì)不同類(lèi)型的細(xì)胞既可以促進(jìn)其增殖、生長(zhǎng)分化，也可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，是一種細(xì)胞生長(zhǎng)的雙向調(diào)節(jié)因子。近來(lái)有學(xué)者通過(guò)先提取樣本的DNA，選擇特定基因標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。篩選出TGFβ可能為腭裂發(fā)生的易感基因。因此，本實(shí)驗(yàn)預(yù)通過(guò)維甲

4、酸建立C57BL／6J系小鼠腭裂模型，在此基礎(chǔ)上通過(guò)免疫組化來(lái)檢測(cè)TGFβl和TGFβ3在維甲酸誘導(dǎo)腭裂以及正常C57BL/6J系小鼠腭部表達(dá)的時(shí)空變化，為進(jìn)一步研究做準(zhǔn)備。 方法：選10周齡左右，雄性體重在25克以上，雌性體重在20克以上的C57BL/6J小鼠。于第一日晚5時(shí)按雌雄比例2：1合籠，次日早8點(diǎn)檢查陰栓情況，陽(yáng)性者記為妊娠0天(gestation 0day，GD0)。共得孕鼠(10 )只，將所得孕鼠隨機(jī)分成兩組：第

5、一組為實(shí)驗(yàn)組，共(5)只；第二對(duì)照組為組，共(5)只。實(shí)驗(yàn)組孕鼠在GD10上午10時(shí)按照0.01 ml/g體重灌注10mg/ml的維甲酸植物油溶液，對(duì)照組小鼠按0.01ml/g體重灌注植物油。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別于GD14、GD15、GD16 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)小鼠取出胚胎。取胚胎鼠頭固定、包埋后切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)TGFβ1和TGFβ3在各時(shí)間點(diǎn)于小鼠腭部的表達(dá)情況。由此，得出TGFβ1和TGFp3在維甲酸誘導(dǎo)腭裂小鼠以及正常小鼠腭突

6、中的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1維甲酸給藥組與對(duì)照組間充質(zhì)中TGFβ3的表達(dá)隨著胚胎的發(fā)育都有所降低，GD14、GD16維甲酸給藥組與對(duì)照組間充質(zhì)中TGFβ3的表達(dá)相同，GD15給藥組TGFβ3的表達(dá)偏高；給藥組與對(duì)照組早期(GD14，GD15) TGFβ1的表達(dá)較為一致，隨著胚胎的發(fā)育有所升高，然而在發(fā)育后期(GD16)TGFβl在實(shí)驗(yàn)組腭突中的表達(dá)較對(duì)照組偏高。 2維甲酸給藥組中嵴上皮中的TGFβ3一直處于高表達(dá)狀

7、態(tài)，而對(duì)照組中嵴上皮中TGFβ3的表達(dá)隨胚胎的發(fā)育逐漸降低；給藥組中嵴上皮中TGFβ1的表達(dá)隨胚胎的發(fā)育明顯升高，對(duì)照組中嵴上皮中TGFβ1的表達(dá)則是先升高而后降低。 3維甲酸給藥組與對(duì)照組鼻腔側(cè)上皮中TGFβ3的表達(dá)在GD14相同，GD15給藥組比對(duì)照組高，GD16則對(duì)照組稍高；維甲酸給藥組與對(duì)照組鼻腔側(cè)上皮中TGFβ1的表達(dá)在GD14時(shí)相同，GD15給藥組比對(duì)照組偏低，GD16實(shí)驗(yàn)組TGFβ1表達(dá)明顯低于對(duì)照組。 結(jié)

8、論： 1、實(shí)驗(yàn)組 TGFβ3在發(fā)育早期(GD14，GD15)間充質(zhì)中的表達(dá)偏高，TGFβ1的表達(dá)偏低，說(shuō)明TGFβ1和TGFβ3可能通過(guò)抑制間充質(zhì)細(xì)胞的增殖，影響腭突的上抬，誘發(fā)腭裂。 2、實(shí)驗(yàn)組中嵴上皮中TGFβ3始終處于高水平表達(dá)，可能使中嵴上皮向口腔側(cè)上皮異常分化；晚期(GD16)TGFβ1的高水平表達(dá)，也可能促進(jìn)中嵴上皮的異常分化。可推測(cè)。TGFβ1和TGFβ3可能誘導(dǎo)中嵴上皮的異常分化，誘發(fā)腭裂。 3、