心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)心臟干細(xì)胞歸巢.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：缺血再灌注損傷刺激SCF表達(dá)并誘導(dǎo)心臟干細(xì)胞歸巢實(shí)驗
　　 缺血再灌注損傷(Ischemia/reperfusion，I/R)是引起心力衰竭的重要原因。近年來寄居在成人心臟的c-kit陽性的心臟干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)被認(rèn)為是修復(fù)損傷心肌的最合適的細(xì)胞類型。但是，缺血再灌注損傷是否可以誘導(dǎo)CSCs歸巢至損傷的心肌尚不清楚。
　　 干細(xì)胞的的激活和

2、遷移通常是由趨化因子調(diào)控的。KIT配基，又稱干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)則被認(rèn)為可能是誘導(dǎo)CSCs遷移和歸巢的重要趨化因子。我們推測，在心臟缺血再灌注損傷中SCF/c-kit信號途徑可能發(fā)揮著誘導(dǎo)心臟干細(xì)胞遷移的重要作用，從而修復(fù)心肌損傷并改善心功能。
　　 目的：
　　 通過建立心肌缺血再灌注模型，觀察心肌損傷后SCF的表達(dá)變化以及其對CSCs歸巢的影響。
　　 方法：
　　

3、建立Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌缺血再灌注模型，采用RT-PCR，western blot以及免疫組化方法檢測SCF的表達(dá)變化。并于誘導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷之前將BrdU標(biāo)記的CSCs注射在房室交界，分別于大鼠心肌缺血后不同的再灌注時間點(diǎn)切取損傷部位心肌組織制作冰凍切片并進(jìn)行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下計數(shù)遷移入損傷區(qū)域的CSCs數(shù)目。體外實(shí)驗中，提取乳SD大鼠心肌細(xì)胞，采用模擬的缺血再灌注損傷模型誘導(dǎo)心肌細(xì)胞缺血再灌注損

4、傷，通過RT-PCR和ELISA方法檢測心肌細(xì)胞SCF的表達(dá)。
　　 結(jié)果：RT-PCR，western blot和免疫組化的結(jié)果均顯示大鼠心肌缺血再灌注損傷后的第三天，SCF的表達(dá)顯著高于假手術(shù)組。缺血再灌注損傷后CSCs在缺血區(qū)域的聚集隨時間延長而呈上升趨勢，并于再灌注三天后的聚集具有統(tǒng)計學(xué)意義。心功能的結(jié)果顯示，缺血再灌注三周后接受CSCs注射與未接受CSCs注射的大鼠相比較，前者的心功能明顯恢復(fù)。同時體外實(shí)驗的結(jié)果顯示，

5、模擬的缺血再灌注明顯刺激了心肌細(xì)胞SCF的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗表明，缺血再灌注損傷刺激了心肌細(xì)胞高度表達(dá)SCF，并誘導(dǎo)CSCs歸巢，進(jìn)而參與損傷心肌的修復(fù)及心功能的改善。
　　 第二部分：缺血再灌注損傷活化NF-кB信號而上調(diào)SCF表達(dá)
　　 目前對于心肌缺血再灌注過程中調(diào)控SCF表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚無報道。DaSilva的研究首次報道了SCF基因的第一個內(nèi)含子上存在著核因子kappaB (

6、Nuclearfactor-kappaB，NF-κB)的反應(yīng)元件，提供了NF-кB 激活參與SCF表達(dá)的可能。NF-кB包括P65和P50 兩個亞基，在正常條件下NF-кB 在胞漿內(nèi)與其主要的抑制蛋白IκBα結(jié)合而處于非激活狀態(tài)。一旦出現(xiàn)刺激，IκBα將迅速被上游激酶磷酸化，并通過泛素途徑發(fā)生降解。這樣沒有了抑制蛋白約束的NF-кB 二聚體便可自由進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。目前尚未有研究闡述缺血再灌注損傷對于SCF表達(dá)的調(diào)控，在本實(shí)

7、驗中我們設(shè)想缺血再灌注損傷可能通過激活NF-кB 而調(diào)控SCF的表達(dá)。
　　 目的：
　　 建立心肌缺血再灌注模型，檢測NF-кB的激活及其上游抑制蛋白IκBα的表達(dá)，觀察其對SCF表達(dá)和CSCs歸巢的影響。
　　 方法：
　　 建立SD大鼠心肌缺血再灌注模型，采用凝膠電泳遷移率實(shí)驗（electrophoreticmobility shift assay，EMSA）的方法檢測NF-кB的表達(dá)變化，并采用w

8、estern blot檢測IκBα和phosphor-IκBα的表達(dá)情況。應(yīng)用NF-кB的抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC，200 mg/kg)，于誘導(dǎo)大鼠心肌缺血前30分鐘時和再灌注開始時兩次腹腔給藥，觀察NAC對NF-кB活化、SCF表達(dá)和CSCs歸巢的影響。體外實(shí)驗中，分別采用轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體介導(dǎo)的NF-кB誘捕物寡核甘酸(NF-κB decoy oligodeoxynucleotide，NF-κB

9、 decoy ODN,1mM)和加入NAC(10mM)兩種方法抑制NF-кB的激活，并觀察其對SCF表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：EMSA的結(jié)果顯示缺血后再灌注30分鐘時NF-кB的表達(dá)開始明顯上調(diào)，至2小時達(dá)到峰值。Western blot的結(jié)果顯示IκBα蛋白在缺血再灌注15分鐘后明顯發(fā)生磷酸化而致IκBα蛋白含量下降。體內(nèi)應(yīng)用NF-кB的抑制劑NAC，不僅顯著抑制了NF-кB的激活，并且明顯減弱了SCF的表達(dá)和CSCs的歸巢，