心肌缺血再灌注損傷誘導心臟干細胞歸巢.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：缺血再灌注損傷刺激SCF表達并誘導心臟干細胞歸巢實驗
　　 缺血再灌注損傷(Ischemia/reperfusion，I/R)是引起心力衰竭的重要原因。近年來寄居在成人心臟的c-kit陽性的心臟干細胞(cardiac stem cells，CSCs)被認為是修復損傷心肌的最合適的細胞類型。但是，缺血再灌注損傷是否可以誘導CSCs歸巢至損傷的心肌尚不清楚。
　　 干細胞的的激活和

2、遷移通常是由趨化因子調控的。KIT配基，又稱干細胞因子(stem cell factor，SCF)則被認為可能是誘導CSCs遷移和歸巢的重要趨化因子。我們推測，在心臟缺血再灌注損傷中SCF/c-kit信號途徑可能發(fā)揮著誘導心臟干細胞遷移的重要作用，從而修復心肌損傷并改善心功能。
　　 目的：
　　 通過建立心肌缺血再灌注模型，觀察心肌損傷后SCF的表達變化以及其對CSCs歸巢的影響。
　　 方法：
　　

3、建立Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌缺血再灌注模型，采用RT-PCR，western blot以及免疫組化方法檢測SCF的表達變化。并于誘導心肌缺血再灌注損傷之前將BrdU標記的CSCs注射在房室交界，分別于大鼠心肌缺血后不同的再灌注時間點切取損傷部位心肌組織制作冰凍切片并進行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下計數(shù)遷移入損傷區(qū)域的CSCs數(shù)目。體外實驗中，提取乳SD大鼠心肌細胞，采用模擬的缺血再灌注損傷模型誘導心肌細胞缺血再灌注損

4、傷，通過RT-PCR和ELISA方法檢測心肌細胞SCF的表達。
　　 結果：RT-PCR，western blot和免疫組化的結果均顯示大鼠心肌缺血再灌注損傷后的第三天，SCF的表達顯著高于假手術組。缺血再灌注損傷后CSCs在缺血區(qū)域的聚集隨時間延長而呈上升趨勢，并于再灌注三天后的聚集具有統(tǒng)計學意義。心功能的結果顯示，缺血再灌注三周后接受CSCs注射與未接受CSCs注射的大鼠相比較，前者的心功能明顯恢復。同時體外實驗的結果顯示，

5、模擬的缺血再灌注明顯刺激了心肌細胞SCF的表達。
　　 結論：
　　 本實驗表明，缺血再灌注損傷刺激了心肌細胞高度表達SCF，并誘導CSCs歸巢，進而參與損傷心肌的修復及心功能的改善。
　　 第二部分：缺血再灌注損傷活化NF-кB信號而上調SCF表達
　　 目前對于心肌缺血再灌注過程中調控SCF表達的信號轉導機制尚無報道。DaSilva的研究首次報道了SCF基因的第一個內含子上存在著核因子kappaB (

6、Nuclearfactor-kappaB，NF-κB)的反應元件，提供了NF-кB 激活參與SCF表達的可能。NF-кB包括P65和P50 兩個亞基，在正常條件下NF-кB 在胞漿內與其主要的抑制蛋白IκBα結合而處于非激活狀態(tài)。一旦出現(xiàn)刺激，IκBα將迅速被上游激酶磷酸化，并通過泛素途徑發(fā)生降解。這樣沒有了抑制蛋白約束的NF-кB 二聚體便可自由進入核內，調控下游基因的轉錄。目前尚未有研究闡述缺血再灌注損傷對于SCF表達的調控，在本實

7、驗中我們設想缺血再灌注損傷可能通過激活NF-кB 而調控SCF的表達。
　　 目的：
　　 建立心肌缺血再灌注模型，檢測NF-кB的激活及其上游抑制蛋白IκBα的表達，觀察其對SCF表達和CSCs歸巢的影響。
　　 方法：
　　 建立SD大鼠心肌缺血再灌注模型，采用凝膠電泳遷移率實驗（electrophoreticmobility shift assay，EMSA）的方法檢測NF-кB的表達變化，并采用w

8、estern blot檢測IκBα和phosphor-IκBα的表達情況。應用NF-кB的抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC，200 mg/kg)，于誘導大鼠心肌缺血前30分鐘時和再灌注開始時兩次腹腔給藥，觀察NAC對NF-кB活化、SCF表達和CSCs歸巢的影響。體外實驗中，分別采用轉染脂質體介導的NF-кB誘捕物寡核甘酸(NF-κB decoy oligodeoxynucleotide，NF-κB

9、 decoy ODN,1mM)和加入NAC(10mM)兩種方法抑制NF-кB的激活，并觀察其對SCF表達的影響。
　　 結果：EMSA的結果顯示缺血后再灌注30分鐘時NF-кB的表達開始明顯上調，至2小時達到峰值。Western blot的結果顯示IκBα蛋白在缺血再灌注15分鐘后明顯發(fā)生磷酸化而致IκBα蛋白含量下降。體內應用NF-кB的抑制劑NAC，不僅顯著抑制了NF-кB的激活，并且明顯減弱了SCF的表達和CSCs的歸巢，