采用基因芯片技術(shù)篩選急性髓系白血病細(xì)胞中的甲基化沉默基因.pdf

1、背景與目的：白血病是由細(xì)胞增殖和分化成熟失衡所引起一種常見的造血系統(tǒng)惡性疾病，其發(fā)生發(fā)展是多因素參與、多步驟的復(fù)雜過程，涉及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變。DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控最常見的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一，異常甲基化基因不僅在白血病發(fā)病中起著重要作用，而且可能是白血病的特異性治療靶標(biāo)。因此，篩選新的白血病甲基化沉默基因，將有助于揭示白血病的發(fā)病機(jī)制，為白血病的防治提供重要的理論依據(jù)和科學(xué)基礎(chǔ)。 方法：以急性髓系白血病(acute m

2、yelogenous leukemia，AML)細(xì)胞系HL-60為對象，應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-2dC)處理HL-60細(xì)胞，采用MTT比色試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、瑞氏染色及Hochest33342染色觀察5-aza-2dC對HL-60細(xì)胞的生長，細(xì)胞周期，分化及凋亡的影響；采用人類全基因組U133+2.0芯片比較5-aza-2dC處HL-60細(xì)胞前后基因表達(dá)譜的變

3、化，采用RT-PCR法驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果，MSP法檢測基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化情況，篩選AML細(xì)胞中的甲基化沉默基因。 結(jié)果：1.5-aza-2dC呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制HL-60細(xì)胞的生長，阻滯HL-60細(xì)胞于G2/M期，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)HL-60細(xì)胞的髓系分化抗原CD11b的表達(dá)，促進(jìn)HL-60細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化。5-aza-2dC在低濃度(0.5 μmol/L)時(shí)促分化作用最明顯，而在高濃度(5.0

4、μmol/L)時(shí)誘導(dǎo)凋亡的作用最明顯；2.采用基因芯片技術(shù)篩選到117個(gè)差異表達(dá)基因，其中109個(gè)基因在5-aza-2dC處理后表達(dá)上調(diào)，8個(gè)表達(dá)下調(diào)，差異基因的功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、Toll樣受體信號通路和組氨酸代謝通路等；3.采用RT-PCR法檢測12個(gè)表達(dá)上調(diào)基因(ANXA2，CTNND1，S100A9，S100A8，NQ01，GLIPR1，EPAS1，PRF1，H19，PHLDA1，THBS1，BCSC1)在5-

5、aza-2dC處理HL-60細(xì)胞前后的表達(dá)水平，結(jié)果與基因芯片分析結(jié)果一致；4。采用MSP法檢測8個(gè)經(jīng)過表達(dá)驗(yàn)證了的基因(ANXA2，CTNND1，GLIPR1，EPAS1，PRF1，H19，PHLDA1，THBS1)啟動子的甲基化情況，結(jié)果顯示經(jīng)5-aza-2dC處理后，其啟動子非甲基化水平上調(diào)，而甲基化水平下調(diào)，提示這8個(gè)基因?yàn)镠L-60細(xì)胞中的甲基化沉默基因。 結(jié)論：1.甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2dC能抑制急性髓系白

6、血病細(xì)胞HL-60的生長，阻滯HL-60細(xì)胞于G2/M期，并能促進(jìn)HL-60細(xì)胞分化和誘導(dǎo)其凋亡，這些作用可能與5-aza-2dC抗急性髓系白血病作用有關(guān)；2.采用基因芯片技術(shù)比較了甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2dC處理HL-60細(xì)胞與對照細(xì)胞的基因組表達(dá)譜差異，篩選到117個(gè)差異基因，其中109個(gè)表達(dá)上調(diào)，8個(gè)表達(dá)下調(diào)。3.采用基因芯片與MSP檢測技術(shù)相結(jié)合的方法篩選HL-60細(xì)胞中的甲基化沉默基因，發(fā)現(xiàn)并初步證實(shí)了HL-60細(xì)胞中