基因芯片定量檢測急性白血病E-cadherin基因甲基化的研究.pdf

1、目的:CpG位點的異常甲基化是腫瘤早期而且是常見的基因改變。擬建立一種基因芯片，能夠定量檢測急性白血病E-cadherin基因的甲基化改變。初步探討基因芯片在腫瘤甲基化檢測中的作用。 方法:用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，并以此為模板進行PCR擴增。目的序列中未甲基化的CpG位點被翻轉成TpG，而甲基化的CPG位點保持不變。設計五組探針構建一種檢測E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化改變的芯片。每組探針包括分別與完全甲基化D

2、NA和完全非甲基化DNA互補的兩條探針，檢測相鄰3或4個CpG位點。通過TA克隆、PCR以及基因測序，確保獲得大量Cy3標記的甲基化純陽性目的序列和甲基化純陰性目的序列。將兩者按不同比例混合，與固定好5組探針的基因芯片雜交，得到不同檢測位點的熒光強度圖。根據(jù)熒光強度圖繪制定量檢測用的標準曲線圖。最后將白血病骨髓樣本經(jīng)抽提DNA、亞硫酸氫鹽處理、PCR擴增后獲得靶序列。將靶序列與芯片雜交，用熒光掃描儀掃描，讀取熒光強度，用標準曲線圖定量。

3、 結果:5組探針對應的5條熒光強度標準曲線圖，R<'2>=0.9660～0.9963，均呈很好的線性關系，可以用來消除背景“噪音”，定量檢測樣本。然后用基因芯片成功的定量檢測了5例急性白血病樣本E-cadherin基因的甲基化改變，5個檢測區(qū)域不同程度發(fā)生了甲基化，且發(fā)生高甲基化的區(qū)域一致。檢測結果經(jīng)過基因測序驗證。 討論:芯片上探針檢測的可重復性和精確性良好，并成功實現(xiàn)定量檢測待測樣本的甲基化改變?；蛐酒軌?/p>